研究背景老年人、糖尿病(Type 2 Diabetes,TD2)和慢性肾功能不全(Chronic Renal Failure,CRF)晚期的患者发生心血管事件风险增加,其中动脉钙化(Arterial Calcification,AC)被认为是心血管疾病发病率和死亡率升高的重要危险因素之一。血管钙化使血管壁顺应性降低,收缩压升高,舒张压降低,并导致心脏肥大和扩张,冠状动脉有效灌注量降低。AC也是评价TD2和CRF患者预后的一项重要指标,因此预防AC对于诸多心血管疾病的发展和治疗具有重要临床意义。但目前临床上仍缺乏有效的治疗手段。AC的形成是一个受基因调控的过程,类似于骨代谢和发育的过程。然而近期也有研究报道[1,2],在高磷诱导的血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)钙化过程中,VSMCs凋亡发挥了重要作用。Proudfoot等研究也证实[3],VSMCs释放凋亡小体要先于钙结晶的形成,即凋亡是钙化形成中关键的一步。凋亡细胞产生的凋亡小体和磷脂酰丝氨酸分子层形成了适合钙离子和矿物质沉积的结合点,因此凋亡的VSMCs被认为是钙化形成的“自然发源地”。维生素K(Vitamin K,VK)作为辅助因子参与蛋白质转录翻译后的羧基化修饰。近期有一项研究报道[4],VK通过激活基质Gla蛋白(Matrix Gla Protein,MGP)从而抑制华法林诱导的大鼠AC。由于VK参与了MGP谷氨酸残基转录翻译后羧基化修饰成γ-羧基谷氨酸的过程,因此该蛋白被称为维生素K依赖蛋白(VK-Dependent Protein,VKDP)。除MGP外,生长抑制特异蛋白6(Growth Arrest Specific Gene 6Protein,Gas 6)也是一重要的VKDP,表达于多种细胞,可与酪氨酸蛋白激酶受体(Tyro3,Axl,Mer)结合后发挥不同生物学功能如介导细胞存活、迁移、趋化和吞噬作用,其中抗细胞凋亡作用研究较明确。Son等研究[5]证实高磷诱导的VSMCs钙化是由于Gas 6/Axl抗凋亡信号通路的下调导致细胞凋亡所引起的。那么VK是否能够通过上调Gas 6/Axl信号通路抑制VSMCs钙化呢?此外由于不同器官组织细胞中蛋白羧基化修饰所需VK类型不同,肝脏中主要需要由绿叶植物合成的叶绿醌(Vitamin K1,VK1),外周组织则主要依赖于甲基萘醌(Vitamin K2,VK2),且Gas 6高表达于VSMCs。根据目前国内外取得的研究进展,我们提出如下问题:①VK2是否能够抑制大鼠VSMCs钙化形成?②VK2是否能够通过上调Gas 6/Axl/p-Akt/Bcl-2信号通路的表达水平进而抑制大鼠VSMCs钙化呢?研究目的1.构建大鼠VSMCs钙化模型,明确VSMCs钙化与细胞凋亡相关性。2.探讨VK2是否能够抑制大鼠VSMCs钙化形成和凋亡,观察VK2对抗细胞凋亡信号通路Gas 6/Axl/p-Akt/Bcl-2蛋白表达水平的影响。3.明确Gas 6/Axl/p-Akt/Bcl-2信号通路在大鼠VSMCs钙化形成过程中的作用,阐明VK2抑制大鼠VSMCs钙化的机制。研究方法1.80-100 g的雄性SD大鼠2只,无菌条件下分离大鼠胸主动脉并剪成动脉环种于细胞培养瓶中,待细胞培养至第3代时进行VSMCs鉴定,实验采用第3-8代VSMCs。2.将大鼠VSMCs随机分为对照组(Control组)和钙化组(Ca2++Pi组),其中Ca2++Pi组给予含7.2 m M氯化钙(Ca Cl2)和10 m Mβ-甘油磷酸钠(β-Sodium Glycerophosphate,β-GP)的培养基,并设置4个不同时间点干预,分别为Ca2++Pi 2d组、Ca2++Pi 4 d组、Ca2++Pi 6 d组和Ca2++Pi 8 d组。分别采用茜素红S染色法和邻甲酚肽络合酮比色法检测各组VSMCs钙结节形成情况和钙含量。3.应用TUNEL免疫荧光染色法,在激光共聚焦显微镜下观察各组大鼠VSMCs凋亡情况并计算凋亡率。4.在钙化培养基干预VSMCs钙化的同时应用凋亡抑制剂,通过邻甲酚肽络合酮比色法和TUNEL凋亡染色法观察细胞凋亡对VSMCs钙化形成的影响,采用Pearson相关性分析法分析VSMCs凋亡与钙化的相关性。5.将大鼠VSMCs随机分为对照组、Ca2++Pi组和Ca2++Pi+VK2组,其中Ca2++Pi+VK2组又根据VK2剂量不同分为4组,分别为Ca2++Pi+1μM VK2组、Ca2++Pi+5μM VK2组、Ca2++Pi+10μM VK2组和Ca2++Pi+50μM VK2组。采用茜素红S染色法和邻甲酚肽络合酮比色法分别检测各组VSMCs钙结节形成情况和钙含量。采用流式细胞仪检测各组VSMCs凋亡情况。6.采用Western Blotting免疫印迹法检测各组细胞中Gas 6、Axl、p-Akt、Bcl-2表达情况。7.采用邻甲酚肽络合酮比色法检测不同浓度的重组鼠Gas 6蛋白(Recombinant Mouse Gas 6 protein,rm Gas 6)对VSMCs钙化的影响,TUNEL凋亡染色法检测不同浓度rm Gas 6对VSMCs凋亡的影响。8.通过Western blotting免疫印迹法筛选Axl抑制剂R428的有效作用浓度。9.应用R428阻断Gas 6/Axl信号通路,通过钙含量和细胞凋亡情况检测VK2抑制VSMCs凋亡和钙化形成状况。研究结果1.与对照组相比,钙化培养基干预VSMCs第6 d即Ca2++Pi 6 d组钙结节形成及钙含量增加(P<0.05);Ca2++Pi 8 d组与对照组相比,钙结节和钙含量显著增加(P<0.05);ALP活性显著升高,细胞核上核心结核因子Runx 2表达也明显增加(P<0.05)。2.Ca2++Pi组的细胞凋亡率升高具有时间依赖性,Ca2++Pi 6 d组凋亡率为(15.98±1.492)%,Ca2++Pi 8 d组凋亡率达(22.37±2.15)%,与对照组(6.44±0.89)%相比显著升高(P<0.001)。3.VSMCs的钙化形成及凋亡率对凋亡抑制剂(N-苯甲基氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮,ZVAD.fmk)具有剂量依赖性,2μM ZVAD.fmk能够显著降低VSMCs钙含量和凋亡率,分别为(14.69±2.768)mg/μg和(3.867±1.55)%,对照组的钙含量和凋亡率分别为(106.2±11.82)mg/μg和(21.07±3.037)%,两组相比具有显著性差异(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示:相关系数R2=0.8504,即细胞凋亡与钙化具有显著相关性(P<0.001﹚。4.VSMCs的钙含量及凋亡率降低对VK2具有剂量依赖性。Ca2++Pi组的钙含量和凋亡率分别为(158±22.62)mg/μg和(19.87±2.554)%,Ca2++Pi+10μM VK2组及Ca2++Pi+50μM VK2组钙含量和凋亡率分别为(57.33±8.36)mg/μg、(9±1.21)%和(53.94±8.742)mg/μg、(8.1±0.793)%,与Ca2++Pi组相比,两组均降低(P<0.05),但是Ca2++Pi+50μM VK2组与Ca2++Pi+10μM VK2组相比无显著差异(P>0.05)。5.对照组中Gas 6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白与内参蛋白的灰度值比值分别为(0.8187±0.096)、(0.679±0.082)、(0.959±0.089)、(0.867±0.036),Ca2++Pi组分别为(0.301±0.037)、(0.262±0.042)、(0.589±0.092)、(0.479±0.027),与对照组相比,Ca2++Pi组Gas 6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。Ca2++Pi+10μM VK2组Gas 6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白灰度值比值分别为(0.816±0.084)、(0.627±0.067)、(1.064±0.11)、(0.766±0.054),与Ca2++Pi组相比,Gas 6、Axl、p-Akt和Bcl-2蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。6.Ca2++Pi组的钙含量和凋亡率分别为(114.4±11.15)mg/μg和(17.03±1.01)%,Ca2++Pi+400 n M rm Gas 6组VSMCs的钙含量和凋亡率降低至(48.18±15.17)mg/μg和(5±0.66)%,两组相比具有显著性差异(P<0.05)。7.Axl抑制剂R428(2μM)可以显著抑制Axl的功能,即抑制Akt磷酸化。与对照组(0.613±0.035)相比,Ca2++Pi+2μM R428组p-Akt蛋白与t-Akt蛋白灰度值比值降低至(0.179±0.021),两组相比具有显著性差异(P<0.05)。8.Ca2++Pi组的钙含量和凋亡率分别为(141.8±27.75)mg/μg和(17.03±1.01)%;Ca2++Pi+R428组钙含量和凋亡率分别为(218.4±18.31)mg/μg和(28.3±6.86)%,与Ca2++Pi组相比明显降低(P<0.05);Ca2++Pi+R428+VK2组的钙含量和凋亡率分别为(182.3±14.46)mg/μg和(22.7±2.79)%,与Ca2++Pi组相比无显著性差异(P>0.05),与Ca2++Pi+R428组相比钙含量和凋亡率均有所降低,但无显著性差异(P>0.05)。研究结论通过研究我们发现7.2 m M Ca Cl2联合10 m Mβ-GP能够成功诱导VSMCs钙化形成且VSMCs凋亡率增加,明确了钙化形成与细胞凋亡具有相关性。发现了VK2能够抑制VSMCs钙化及细胞凋亡,其中Gas 6/Axl/p-Akt/Bcl-2抗凋亡信号通路在VK2抑制VSMCs钙化过程中发挥重要作用,阐明了VK2抑制VSMCs钙化的药理作用机制。该研究为AC的预防和治疗提供了新的靶点及重要的理论依据。
