苹果树腐烂病(Valsa canker of apple)在我国分布广、发病重,果农称之为苹果树的“癌症”。由于对苹果树腐烂病菌(Valsa mali var. mali)的致病机理知之甚少,制约了对该病害发生规律的深入了解,致使病害防治工作低效、盲目和被动,造成了严重的产量和经济损失。因此,在目前仍没有有效抗病品种的前提下,如何利用分子生物学技术揭示该病菌致病的分子机理,从根本上揭示苹果树腐烂病菌的致病机理及其致病过程中基因调控的机制,明确苹果树腐烂病菌与寄主互作的本质,将大大提高苹果树腐烂病的防治理论与实践研究进程,为生产上科学、有效的控制苹果树腐烂病提供坚实的理论基础。因此,我们以苹果树腐烂病菌分生孢子为转化受体,双元载体pBIG2RHPH2-GFP-GUS为转化供体,利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)及PEG介导的遗传转化方法对苹果树腐烂病菌(Valsa mali var. mali)进行了转化,初步建立了农杆菌及PEG介导的苹果树腐烂病菌遗传转化体系,并对所获得转化子的性质做了初步的研究,主要研究结果如下:1.采用朱琳(2010)建立的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的小麦全蚀病菌的遗传转化体系,略有修改,初步建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的苹果树腐烂病菌的遗传转化体系,即IM培养基中AS浓度为400μM,农杆菌诱导时间为6 h OD600=0.30,苹果树腐烂病菌分生孢子浓度为106个/mL,与400μL农杆菌菌液25℃共培养3 d。2.通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的苹果树腐烂病菌的遗传转化,我们共获得28个含有潮霉素抗性的转化子,转化效率为平均每106个分生孢子可得6个转化子;经过PCR和Southern杂交检测表明,hph抗性基因已导入苹果树腐烂病菌细胞中;转化子在PDA培养基中继代5次后,全部转化子均能正常生长;对转化子的皿内生长特性进行观察,发现转化子的菌落颜色、产孢能力均发生了变化。3.利用PEG融合法对苹果树腐烂病菌的原生体进行转化。于YEPD内培养48 h的苹果树腐烂病菌分生孢子,在酶解液浓度为50 mg/mL Driselase+10 mg/mL Lysing Enzymes情况下,按10 mL酶液/0.5 g湿菌体比例,酶解2 h时可以释放出4×10~7个/mL原生质体。4.通过PEG介导的苹果树腐烂病菌的遗传转化,我们共获得218个转化子,其转化效率为44个/μg DNA。对转化子的PCR检测和Southern杂交分析表明,hph基因已经整合进苹果树腐烂病菌的基因组中。转化子在PDA培养基中继代5次后,87.5%的转化子仍能正常生长。综上所述,本文建立的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)及PEG介导的遗传转化体系可作为进一步建立插入突变体库、筛选致病突变体等的技术平台,进而为克隆相关基因,深入解析苹果树腐烂病菌的致病机制奠定物质和理论基础,最终为病害的有效控制提供新的思路和策略。
