KIAA0157和Hepassocin调节肝源性细胞增殖的机制研究

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细胞的增殖调控是生命体赖以生存和发展的基础,对细胞的增殖调控机制进行研究能够为肿瘤的治疗提供新的药物靶点,并能为药物的研发奠定理论基础。本论文就两个对细胞增殖起调控作用的蛋白KIAA0157和Hepassocin调节细胞增殖的机制进行研究。KIAA0157是一种功能不明的新基因。我们前期的研究发现KIAA0157在多种肿瘤组织中下调表达,过表达可抑制多种细胞的克隆形成能力。本论文研究发现:过表达KIAA0157能增强p53的稳定性和p53活性,RNAi下调细胞内KIAA0157表达加速p53降解,抑制p53活性;KIAA0157以p53依赖的方式抑制细胞集落形成并诱导细胞发生G0期阻滞。KIAA0157可与MDM2发生相互作用,并抑制MDM2介导的p53泛素化和降解。这些研究结果表明KIAA0157可能通过MDM2调节p53稳定性及其活性,并在肿瘤细胞增殖调控方面发挥作用,为今后的癌症治疗提供了新的靶点。Hepassocin(HPS),是一种肝脏特异表达蛋白质,在肝损伤修复、肝源细胞增殖调控中发挥重要作用。前期研究表明HPS可特异性刺激正常肝细胞增殖,但过表达抑制肝肿瘤细胞增殖,其分子机制不明。我们的研究发现:1)采用免疫印迹和ELISA方法证明正常肝细胞系L02细胞能够产生并分泌HPS;2)HPS蛋白质的细胞外分泌依赖于N端22个氨基酸。3)利用FITC标记的HPS证实L02细胞膜上存在HPS特异受体;4)HPS中和抗体可中和L02细胞条件培养液的增殖刺激活性并抑制L02细胞增殖。这些研究表明HPS可通过自分泌循环调节L02细胞增殖,阻断这个循环可抑制L02细胞的增殖。为研究HPS对肝癌细胞生长的影响,我们在HepG2肝癌细胞中过表达野生型HPS和N端22个氨基酸缺失HPS(非分泌型HPS),结果发现两种HPS均可抑制HepG2细胞的克隆形成能力,并导致细胞发生G0/G1期阻滞,但非分泌型HPS的抑制作用要显著强于野生型HPS。此外,虽然HepG2肝癌细胞也产生和分泌HPS,但外源HPS对肝癌细胞的增殖并无明显影响。这些结果表明HPS可能通过细胞内机制抑制肝癌细胞的增殖。我们对Hepassocin对肝细胞及肝癌细胞生长调节机制的研究为今后Hepassocin作为肝损伤类药物的开发提供了理论平台。
摘要第1-4页
ABSTRACT第4-9页
前言第9-11页
第一章 文献综述第11-21页
   ·KIAA0157第12-15页
     ·发现第12页
     ·KIAA0157 的结构域第12-13页
     ·KIAA0157 的功能及研究进展第13-15页
     ·KIAA0157 的相互作用蛋白质第15页
   ·Hepassocin第15-19页
     ·肝再生相关细胞因子第16-17页
     ·细胞因子的作用方式第17-18页
     ·Hepassocin 的发现与其结构特点第18页
     ·Hepassocin 与肝再生第18-19页
     ·Hepassocin 与肝癌第19页
   ·本课题的研究意义第19-21页
第二章 KIAA0157 调节细胞增殖的机制研究第21-57页
   ·材料与方法第21-32页
     ·主要仪器设备第21-22页
     ·菌株和载体第22页
     ·细胞第22页
     ·主要试剂及试剂盒第22-23页
     ·相关溶液的配置第23-24页
     ·细胞培养第24页
     ·实验相关操作第24-32页
   ·实验结果第32-53页
     ·KIAA0157 以p53 依赖方式调节细胞生长第32-35页
       ·KIAA0157 能够抑制HepG2 的克隆形成能力第32-33页
       ·KIAA0157 以p53 依赖的形式影响细胞的克隆形成能力第33-34页
       ·KIAA0157 以p53 依赖的方式影响细胞周期第34-35页
     ·KIAA0157 能激活p53 的转录活性第35-37页
     ·KIAA0157 上调p53 的蛋白质表达第37-42页
       ·KIAA0157 过表达增加p53 蛋白质水平第37-38页
       ·KIAA0157 能上调内源MDM2 及p21 的表达第38-39页
       ·KIAA0157 在多种细胞中调节p53 蛋白质水平第39页
       ·KIAA0157 对MDM2 的上调不依赖于p53第39-40页
       ·干涉KIAA0157 下调内源性p53 蛋白质的表达第40-42页
     ·KIAA0157 上调p53 通过稳定p53第42-49页
       ·KIAA0157 不能上调p53 的mRNA 水平第42-43页
       ·KIAA0157 不能激活p53 的启动子第43-44页
       ·KIAA0157 上调外源p53 蛋白质第44-45页
       ·KIAA0157 延长p53 蛋白质的半衰期第45-46页
       ·KIAA0157 抑制MDM2 介导的p53 的降解第46-47页
       ·KIAA0157 能抑制p53 和MDM2 的泛素化第47-49页
     ·KIAA0157 与MDM2 存在相互作用第49-53页
       ·KIAA0157 的亚细胞定位第49页
       ·KIAA0157 与MDM2 存在相互作用第49-51页
       ·MDM2 与KIAA0157 相互作用结构域验证第51-53页
   ·讨论第53-55页
   ·本章小结第55-57页
第三章 Hepassocin 调节细胞增殖的机制研究第57-88页
   ·材料与方法第57-62页
     ·仪器设备第57-58页
     ·菌株和载体第58页
     ·细胞第58页
     ·相关溶液的配置第58-59页
     ·主要试剂及试剂盒第59页
     ·细胞培养第59页
     ·实验相关操作第59-62页
   ·实验结果第62-84页
     ·Hepassocin 通过自分泌循环影响肝细胞的增殖第62-80页
       ·Hepassocin 表达载体的构建第62-64页
       ·Hepassocin 单克隆抗体的制备与筛选第64-69页
       ·Hepassocin 能被肝源细胞系分泌第69-70页
       ·Hepassocin 的分泌由分泌肽所介导第70-71页
       ·Hepassocin 通过自分泌机制促进L02 细胞的增殖第71-73页
       ·Hepassocin 受体的鉴定第73-80页
       ·Hepassocin 对细胞ERK 信号通路的激活依赖于其受体第80页
     ·Hepassocin 对肝癌细胞的作用第80-84页
       ·Hepassocin 不能抑制肝癌细胞的增殖第80-82页
       ·Hepassocin 抑制肝癌细胞增殖通过细胞内机制第82-84页
   ·讨论第84-87页
   ·本章小结第87-88页
第四章 结论与展望第88-90页
   ·结论第88页
     ·KIAA0157 调节细胞增殖机制第88页
     ·Hepassocin 调节细胞增殖机制第88页
   ·展望第88-90页
参考文献第90-99页
附录一 PCR 引物第99-100页
附录二 英文缩略语第100-102页
发表论文和参加科研情况说明第102-103页
致谢第103页
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