马铃薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介导的病毒抗性的比较研究

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马铃薯Y病毒(Potata virus Y, PVY)是马铃薯Y病毒属中的典型种,对马铃薯、烟草等重要经济作物危害相当严重,特别是PVY坏死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而绝产。RNA介导的病毒抗性是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS),是近年来发展起来的一种有效防治植物病毒病害的策略。它是以病毒核酸片段为转基因而诱导的基因沉默,不但能将转基因的转录产物降解,而且能将入侵的与转基因同源的病毒基因组RNA降解,具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久及生物安全性高等优点。马铃薯Y病毒各基因编码的产物在病毒的复制和增殖过程中,表现为不同的功能,因此推测不同的功能基因介导的病毒抗性可能存在差异。目前病毒的衣壳蛋白基因、复制酶基因和移动蛋白基因等均有RNA介导抗性的报道,但尚缺少系统的比较研究。本研究采用RT-PCR技术,克隆马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的P1、HC-Pro、P3、CI基因,进一步亚克隆了P1、HC-Pro、P3、CI基因的3’端cDNA区段,构建茎长度400bp、环长度为100bp的hpRNA结构植物表达载体,转化烟草,进行抗性鉴定。研究结果表明马铃薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介导的病毒抗性存在比较明显的差异。具体结果如下:1. Trizol法提取感染PVY的烟草叶片的总RNA,采用RT-PCR的方法克隆了马铃薯Y病毒基因组P1、HC-Pro、P3、CI 4个基因片段。序列已登录GenBank,登录号为:EU182576。2.以P1、HC-Pro、P3、CI基因区段cDNA为模板,PCR分别扩增各基因3’端400bp和500bpcDNA区段,以pROKII为载体构建了茎长度为400 bp、环长度为100bp的hpRNA结构的植物表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro、pROKⅡ- P3和pROKⅡ-CI。3.将所构建的表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro、pROKⅡ- P3、pROKⅡ-CI利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明重组质粒均已成功导入农杆菌菌株。4.叶盘法转化烟草NC89。经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得转pROKⅡ烟草40株(对照),转pROKⅡ-P1烟草90株、转pROKⅡ- HC-Pro烟草108株、转pROKⅡ- P3烟草94株、转pROKⅡ-CI烟草96株。5.以感染PVYN烟草叶片的汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草。通过症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性比例存在差异。在90株转pROKⅡ-P1的T0代烟草中,有54株表现高度抗病,抗性比例为60.00%;在108株转pROKⅡ- HC-Pro的T0代烟草中,有36株表现高度抗病,抗性比例为33.33%;在100株转pROKⅡ- P3的T0代烟草中,有54株表现高度抗病,抗性比例为57.45%;在96株转pROKⅡ-CI的T0代烟草中,有51株表现高度抗病,抗性比例为53.13%。6.转基因植株的Northern blot分析显示,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因转录的积累量二者之间呈负相关。转基因植株siRNA的Northern blot分析显示,抗病的转基因烟草表现特异的杂交带,而转空质粒pROKⅡ的烟草没有杂交带。表明转基因烟草的抗病性是由RNA介导的病毒抗性所产生的。
摘要第7-9页
ABSTRACT第9-10页
1 引言第13-26页
    1.1 马铃薯Y 病毒属的基因组结构及各蛋白功能第13-14页
    1.2 RNA 介导的病毒抗性第14-17页
        1.2.1 RNA 介导的病毒抗性的提出第14-15页
        1.2.2 RNA 介导的病毒抗性的特点第15-16页
        1.2.3 RNA 介导的病毒抗性是转录后基因沉默的结果第16-17页
    1.3 RNA 干扰(RNAi)第17-24页
        1.3.1 RNAi 的特征第17-19页
        1.3.2 RNAi 的作用机制第19-21页
        1.3.3 hpRNA 与RNAi第21-24页
    1.4 本研究的立题依据和主要研究内容第24-26页
        1.4.1 立题依据第24-26页
2 材料与方法第26-44页
    2.1 材料第26页
        2.1.1 毒源第26页
        2.1.2 供试植物第26页
        2.1.3 菌株、质粒第26页
        2.1.4 常用缓冲液及培养基的配制第26页
        2.1.5 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器第26页
    2.2 方法第26-44页
        2.2.1 不同目的基因片段的获得第26-27页
        2.2.2 RT-PCR 克隆马铃薯Y 病毒基因组不同区段cDNA第27-30页
        2.2.3 不同目的片段的获得第30-31页
        2.2.4 中间载体pROKⅡ-P1-400、pROKⅡ- HC-Pro-400、pROKⅡ-P3-400 和pROKⅡ-CI-400 的构建第31-34页
        2.2.5 植物表达载体的构建第34-36页
        2.2.6 目的基因向烟草中的转化及植株再生第36-37页
        2.2.7 植物总DNA 的提取(CTAB 法)及PCR 检测第37-38页
        2.2.8 转基因植株的抗病性鉴定及ELISA 检测第38页
        2.2.9 转基因植株总 RNA 的提取及 Northern blot 分析第38-42页
        2.2.10 转基因植株siRNA 的提取及siRNA 的Northern blot 分析第42-44页
3 结果与分析第44-59页
    3.1 RT-PCR 扩增 P1、HC-Pro、P3 和 CI 基因第44-46页
        3.1.2 目的片段的扩增和酶切第45-46页
        3.1.3 质粒DNA 酶切第46页
    3.2 重组载体的构建第46-51页
        3.2.1 重组中间载体pROKⅡ-P1-400、pROKⅡ- HC-Pro-400 、pROKⅡ- P3-400 、pROKⅡ-CI-400 的菌落PCR 鉴定第46-47页
        3.2.2 重组中间载体 pROKⅡ-P1-400、pROKⅡ-HC-Pro-400、pROKⅡ- P3-400 、pROKⅡ-CI-400 质粒的酶切鉴定第47-48页
        3.2.3 植物表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro 、pROKⅡ-P3、pROKⅡ-CI 的菌落PCR 鉴定第48-50页
        3.2.4 植物表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro 、pROKⅡ-P3、pROKⅡ-CI 的酶切鉴定第50-51页
    3.3 转化植株的获得第51-52页
    3.4 转化植株的PCR 检测第52-54页
    3.5 转基因植株的抗病性分析第54-56页
    3.6 转基因植株的 Northern blot 分析第56-57页
    3.7 转基因植株 siRNA 的 Northern blot 分析第57-59页
4 讨论第59-63页
5 结论第63-64页
参考文献第64-76页
附录Ⅰ 常用缓冲液及培养基的配制第76-81页
附录Ⅱ常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器第81-82页
附录 III 质粒图谱第82-83页
致谢第83页
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