马铃薯Y病毒(Potata virus Y, PVY)是马铃薯Y病毒属中的典型种,对马铃薯、烟草等重要经济作物危害相当严重,特别是PVY坏死株系(PVYN)可以造成寄主提前死亡而绝产。RNA介导的病毒抗性是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing, PTGS),是近年来发展起来的一种有效防治植物病毒病害的策略。它是以病毒核酸片段为转基因而诱导的基因沉默,不但能将转基因的转录产物降解,而且能将入侵的与转基因同源的病毒基因组RNA降解,具有抗病程度高(近乎免疫)、抗性持久及生物安全性高等优点。马铃薯Y病毒各基因编码的产物在病毒的复制和增殖过程中,表现为不同的功能,因此推测不同的功能基因介导的病毒抗性可能存在差异。目前病毒的衣壳蛋白基因、复制酶基因和移动蛋白基因等均有RNA介导抗性的报道,但尚缺少系统的比较研究。本研究采用RT-PCR技术,克隆马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)的P1、HC-Pro、P3、CI基因,进一步亚克隆了P1、HC-Pro、P3、CI基因的3’端cDNA区段,构建茎长度400bp、环长度为100bp的hpRNA结构植物表达载体,转化烟草,进行抗性鉴定。研究结果表明马铃薯Y病毒P1、HC-Pro、P3、CI基因介导的病毒抗性存在比较明显的差异。具体结果如下:1. Trizol法提取感染PVY的烟草叶片的总RNA,采用RT-PCR的方法克隆了马铃薯Y病毒基因组P1、HC-Pro、P3、CI 4个基因片段。序列已登录GenBank,登录号为:EU182576。2.以P1、HC-Pro、P3、CI基因区段cDNA为模板,PCR分别扩增各基因3’端400bp和500bpcDNA区段,以pROKII为载体构建了茎长度为400 bp、环长度为100bp的hpRNA结构的植物表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro、pROKⅡ- P3和pROKⅡ-CI。3.将所构建的表达载体pROKⅡ-P1、pROKⅡ- HC-Pro、pROKⅡ- P3、pROKⅡ-CI利用冻融法直接导入农杆菌LBA4404。菌液PCR及酶切鉴定证明重组质粒均已成功导入农杆菌菌株。4.叶盘法转化烟草NC89。经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得转pROKⅡ烟草40株(对照),转pROKⅡ-P1烟草90株、转pROKⅡ- HC-Pro烟草108株、转pROKⅡ- P3烟草94株、转pROKⅡ-CI烟草96株。5.以感染PVYN烟草叶片的汁液为接种物,汁液摩擦接种转基因烟草。通过症状观察及ELISA检测表明不同的转基因植株对PVYN的抗性比例存在差异。在90株转pROKⅡ-P1的T0代烟草中,有54株表现高度抗病,抗性比例为60.00%;在108株转pROKⅡ- HC-Pro的T0代烟草中,有36株表现高度抗病,抗性比例为33.33%;在100株转pROKⅡ- P3的T0代烟草中,有54株表现高度抗病,抗性比例为57.45%;在96株转pROKⅡ-CI的T0代烟草中,有51株表现高度抗病,抗性比例为53.13%。6.转基因植株的Northern blot分析显示,转基因都在RNA水平上得到了表达,抗病性与转基因转录的积累量二者之间呈负相关。转基因植株siRNA的Northern blot分析显示,抗病的转基因烟草表现特异的杂交带,而转空质粒pROKⅡ的烟草没有杂交带。表明转基因烟草的抗病性是由RNA介导的病毒抗性所产生的。