强优势玉米杂交种豫玉22雌穗均一化cDNA文库的构建与鉴定

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本工作通过Trizol Reagent分离了强优势玉米杂交种豫玉22关键发育时期—雌穗分化时期(生长锥伸长和小穗分化、小花分化、花丝始伸和果穗增长)—的总RNA,反转录合成cDNA,构建了均一化cDNA文库,为进一步研究和分离与杂种优势相关的基因构建了技术平台。在雌穗分化期中分别构建四个独立cDNA文库,所提取总RNA紫外分光光度计测得OD260/OD280的比值.为1.87、1.86、1.85和1.99,电泳检测显示18S、28S rRNA条带清晰,且28S亮度明显大于18S。分别以Not Ⅰ primer-adapter为引物合成cDNA第一条链,随后以链置换法合成cDNA双链。经1%琼脂糖凝胶电泳检测:两条链最长可达5kb。在双链cDNA两段加接头,经过Not Ⅰ酶切,cDNA的分级分离,与载体Not Ⅰ-Sal Ⅰ-Cut vector连接,转化生成四个独立cDNA文库,重组率分别为:90%、87%、85%和93%,克隆数目分别为:2.7×105、6.4×104、3.1×105和2.1×104,每个独立库随机挑取200个克隆,PCR检测插入片断长度平均为1.2kb、1.3kb、1.4kb和1.3kb。 豫玉22基因组DNA分别用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ先后酶切,单酶切后用Klenow Fragment和C-21-biotin-dUTP补平末端,固定在链霉亲和素磁珠上,构建成基因组DNA亲和杂交体系,而后取两份均匀混合的体系先预杂交,接着四个独立cDNA文库各取10ug加入进行杂交。结束后,洗脱下杂交上的部分,复性转化生成3×104个克隆的均一化cDNA文库。挑取其中200个克隆检测,插入片断平均大小是1.3kb,其大小分布与独立cDNA文库一样,未发生改变。随机挑取150个克隆进行测序,81.6%的序列为unique ESTs,11.2%的序列含有两个或两个以上的拷贝,它们主要来自多基因家族转录本,一定程度上证明了此均一化文库的均一化是有效性。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4页
第一章 前言第7-21页
    1.大片段DNA插入文库的研究进展第7-10页
        1.1 大片段DNA插入文库(Large size insert genomic library)发展史第7-8页
        1.2 BAC文库的构建第8-9页
        1.3 大片段DNA文库的鉴定第9-10页
        1.4 大片段DNA文库的应用第10页
    2 cDNA文库构建的进展第10-19页
        2.1 代表性第11页
        2.2 cDNA文库的构建的一般步骤(萨姆布鲁克等,2002)第11页
        2.3 类别第11-13页
        2.4 均一化cDNA文库(normalized cDNA library)第13-18页
        2.5 玉米cDNA文库的构建和应用第18-19页
        2.6 cDNA文库的缺点第19页
    3 玉米雌穗分化第19-20页
    4 本工作意义第20-21页
第二章 材料与方法第21-29页
    1 供试材料第21页
    2 实验方法第21-29页
        2.1 取材第21页
        2.2 提取总RNA和纯化mRNA的方法第21-22页
        2.3 构建独立cDNA文库:第22-26页
        2.4 构建亲和体系(储朝晖等,2003)第26-27页
        2.5 饱和杂交第27-28页
        2.6 检测第28-29页
第三章 结果与分析第29-41页
    1 供试材料第29页
    2 cDNA独立文库的构建第29-34页
        2.1 总RNA的提取结果第29-30页
        2.2 mRNA的分离第30页
        2.3 cDNA的合成第30-31页
        2.4 cDNA的分级分离第31页
        2.5 独立cDNA文库的质量鉴定第31-33页
        2.6 cDNA文库的扩增第33-34页
    3 均一化cDNA文库的构建第34-41页
        3.1 克隆的插入片段大小第34-35页
        3.2 测序第35-41页
第四章 讨论第41-45页
    1 RNA的提取和MRNA的分离纯化第41页
    2 构建独立cDNA文库第41页
    3 均一化cDNA文库的评价第41-42页
    4 均一化方法的评价第42-45页
        4.1 两种主要均一化方法特点分析第42页
        4.2 饱和基因组杂交法与其它均一化方法的比较第42-45页
参考文献第45-50页
致谢第50页
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