第一部分RGD-PEG-去细胞瓣复合材料的构建第一节：PEG交联去细胞瓣目的：PEG交联去细胞瓣构建PEG-去细胞瓣材料。方法：合成枝化状PEG,利用SATA法在去细胞瓣上引入巯基,通过迈克尔加成反应,构建PEG交联去细胞瓣材料。生物力学测试交联对支架材料力学性能的影响。结果：PEG交联去细胞瓣构建条件温和易控,交联效果确切；PEG-去细胞瓣材料抗拉强度明显高于单纯去细胞瓣(7.53±032 Mpa vs.5.65±0.28 Mpa,P<0.05),与天然瓣膜抗拉强度相比,差异无统计学差异(P>0.05)。结论：通过迈克尔加成反应,PEG可成功交联去细胞瓣,构建与天然瓣膜抗拉强度相似的PEG-去细胞瓣材料。第二节：构建RGD-PEG-去细胞瓣复合材料目的：PEG-去细胞瓣材料共价接枝GRGDSPC肽,构建RGD-PEG-去细胞瓣复合材料。方法：PEG-去细胞瓣与1mlGRGDSPC肽溶液在37℃发生迈克尔加成反应,分光光度法检测复合材料结合GRGDSPC肽质量,并行免疫荧光定性检测。结果：GRGDSPC肽能有效地结合于PEG-去细胞瓣,免疫荧光法检测证实GRGDSPC肽与PEG-去细胞瓣有效共价接枝。结论：PEG-去细胞瓣材料能够在体外有效地结合GRGDSPC肽,构建RGD-PEG-去细胞瓣复合材料。第二部分生物反应器系统的构建目的：构建生物反应器系统,并对系统进行流量和生物相容性测试。方法通过保定兰格WT600-1F蠕动泵,生物反应器流室,硅胶管道和储液室构建生物反应器系统。生物反应器流室内植入RGD-PEG-去细胞瓣复合材料,测试不同流量下系统工作状态及生物相容性。结果生物反应器通过蠕动泵产生脉动流,能够有效模拟体内血流动力学环境。精确调控生物反应器的流量,可以对TEHV施加不同大小的剪切应力刺激。结论成功构建生物反应器系统,通过对流量的精确调控,可以实现不同大小的剪切应力刺激。第三部分复合材料体外动态构建组织工程心脏瓣膜及其钙化机制研究第一节瓣膜间质细胞分离、培养及鉴定目的：分离、培养、鉴定瓣膜间质细胞。方法：胶原酶消化法分离瓣膜中间质细胞,在含10%FBS培养液中培养,通过免疫荧光对细胞进行鉴定。结果：通过胶原酶消化法可成功从人主动脉瓣中分离出瓣膜间质细胞。原代培养的瓣膜间质细胞单层生长,形态呈梭形,放射状排列,随数量增长相互连接成片,5-7天汇合成单层。细胞鉴定α平滑肌肌动蛋白(a-SMA)免疫荧光染色阳性,波形蛋白(vimentin)免疫荧光染色阳性。结论：胶原酶消化法简单易行,可成功分离出瓣膜中的瓣膜间质细胞。瓣膜间质细胞增殖能力强,可作为组织工程瓣膜理想的种子细胞。第二节复合材料生物反应器内构建组织工程心脏瓣膜目的：RGD-PEG-去细胞瓣复合材料上种植瓣膜间质细胞,生物反应器内构建组织工程心脏瓣膜。方法：RGD-PEG-去细胞瓣复合材料上种植瓣膜间质细胞,生物反应器内体外动态培养。接细胞计数法检测第2h、4h、8h细胞黏附情况,第10天后行形态学观察和DNA含量测定。结果：细胞黏附计数和形态学观察提示,RGD-PEG-去细胞瓣复合材料明显促进瓣膜间质细胞黏附,并形成连续单层细胞覆盖。DNA含量测定提示种植细胞后RGD-PEG-去细胞瓣复合材料较单纯去细胞瓣组和PEG-去细胞瓣组明显增高(25.98±2.45μg瓣叶vs.19.61±1.94μg/瓣叶vs.18.40±1.89μg/瓣叶,P＜0.05)。结论：生物反应器内RGD-PEG-去细胞瓣复合材料,可促进种子细胞的黏附,改善瓣膜支架生物学性能。第三节：阻断Notch-1信号通路诱导组织工程心脏瓣膜钙化目的：RGD-PEG-去细胞瓣复合材料上种植瓣膜间质细胞构建组织工程心脏瓣膜,阻断Notch-1信号通路,生物反应器内动态培养,诱导钙化。方法：3-8代的瓣膜间质细胞培养基中加入γ-分泌酶抑制剂DAPT,阻断Notch-1信号通路,每三至四天换液,共干预3周。种植于RGD-PEG-去细胞瓣复合材料,生物反应器内动态培养10天。标准培养基培养作为阴性对照组。含甘油磷酸、维生素C、地塞米松的钙化培养基培养作为阳性对照组。茜素红染色观察钙沉积。RT-PCR检测α-平滑肌动蛋白、核心结合因子、骨钙素等钙化相关因子表达。Western blot法检测核心结合因子、骨钙索、骨桥蛋白等钙化相关蛋白表达。结果：实验组茜素红染色阳性。RT-PCR提示实验组α-平滑肌动蛋白、核心结合因子、骨钙素等表达较阴性对照组明显升高(P<0.05)。Western blot提示实验组核心结合因子、骨钙素、骨桥蛋白等钙化相关蛋白表达较阴性对照组明显升高(P<0.05)。结论：通过γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch-1信号通路,可成功诱导组织工程心脏瓣膜钙化。
