同源重组对新城疫进化的影响及新城疫Mukteswar疫苗株全长cDNA克隆

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新城疫是一种在世界范围内流行的禽类疫病,自1926年发现以来,曾多次暴发,给世界养禽业带来了巨大的经济损失。其病原—新城疫病毒,属于单负链病毒目(Mononegavirales)副粘病毒科(Paramyxoviridae)禽副粘病毒属(Avulavirus),按致病性分为强毒株、中毒株和弱毒株。其全基因组长为15100多个核苷酸(nucleotide,nt),包含六个基因,分别编码六个结构蛋白,其顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。其中,P基因在转录过程中可发生RNA编辑产生W和V两种非结构蛋白。新城疫病毒突变率高、复制速率快并且拥有庞大的种群数量,因此其进化速度是非常快的。由于RNA聚合酶无校正功能,因此,基因突变在新城疫病毒的进化过程中发挥着重要作用。但近些年来,有关同源重组是否影响新城疫病毒进化的争议不断,从往至今,已被大多数人所认可的观点是—新城疫病毒为负义RNA病毒,是不存在同源重组的;而近几年来,许多研究小组通过生物信息学的方法已陆续发现了一些负义RNA病毒中存在同源重组的证据,但因为缺少实验室证据,依然备受质疑。在本研究中,通过对所有已提交的新城疫病毒的F基因的序列进行分析时,意外的发现了一组重组株,共包含11株,分别为D-JS-23-05、D-SD-21-05、D-SD-22-05、D-SD-24-05、D-ZJ-20-05、D-ZJ-26-05、D-ZJ-27-05、D-SD-29-05、D-SD-32-05、D-ZJ-28-05和D-ZJ-33-05,这些毒株都是从中国西部活野鸭身上分离得到的。这个重组群体的发现是有别于之前重组个体的发现的,这能够证明同源重组在新城疫病毒的进化过程中稳定存在并遗传,并为新城疫病毒中存在同源重组的论断提供了更为有利的证据。当然,有利的实验证据会更具说服力,因此,本实验室正在努力构建新城疫病毒同源重组实验系统。构建新城疫病毒同源重组实验系统的基础就是要构建新城疫病毒的反向遗传系统,主要包括四部分内容:构建全长cDNA克隆、构建表达NP、P、L蛋白的辅助质粒、构建稳定表达T7聚合酶的BHK-21细胞系及将全长cDNA克隆和辅助质粒共转染到稳定表达T7聚合酶的BHK-21细胞系中拯救出活病毒。由于工作量较大,本论文中只是完成了其中最为关键的环节—构建新城疫病毒的全长cDNA克隆,实验材料为新城疫病毒Mukteswar疫苗株,通过分段克隆的方法,最终将Mukteswar的全长cDNA连于低拷贝质粒—pMC18上(全长cDNA的起始位置添加了T7启动子序列,末尾添加了丁肝核酶序列),为构建其反向遗传系统奠定了坚实的基础。
中文摘要第6-8页
Abstract第8-9页
英文缩写一览表第10-11页
第一章 综述第11-23页
    1. 新城疫病毒的概述第11-18页
        1.1 新城疫病毒的基本生物学特性第11-12页
        1.2 NDV 各基因的结构和功能第12-15页
        1.3 NDV 感染与复制第15-16页
        1.4 NDV 的致病性第16页
        1.5 NDV 的演化第16-17页
        1.6 关于同源重组是否影响负义 RNA 病毒进化的争议第17-18页
    2. 反向遗传技术的概述第18-23页
        2.1 反向遗传的概念第18-19页
        2.2 负义 RNA 病毒的反向遗传第19-20页
        2.3 反向遗传技术在 NDV 中的应用第20-23页
第二章 同源重组对新城疫进化的影响第23-28页
    1 材料和方法第23-24页
        1.1 收集并整理序列数据第23页
        1.2 同源重组分析第23-24页
        1.3 系统进化分析第24页
    2 结果第24-26页
        2.1 同源重组分析第24-25页
        2.2 系统进化分析第25-26页
    3 分析与讨论第26-28页
第三章 新城疫 Mukteswar 疫苗株全长 cDNA 分片段克隆与测序第28-50页
    1 材料第28-34页
        1.1 病毒、菌株与质粒第28-29页
        1.2 实验仪器第29-30页
        1.3 实验药品、试剂及试剂盒第30-31页
        1.4 常用溶液配方第31-34页
    2 方法第34-48页
        2.1 新城疫 Mukteswar 疫苗株病毒的活化第34-36页
        2.2 设计新城疫病毒 Mukteswar 全长 cDNA 克隆的构建方案第36-37页
        2.3 新城疫病毒 Mukteswar 疫苗株基因组 RNA 的提取第37-39页
        2.4 RT-PCR(反转录 PCR)扩增特异性的目的片段第39-42页
        2.5 回收纯化目的片段第42-43页
        2.6 将目的片段连于 pMD18-T 载体上形成稳定质粒并测序第43-48页
    3 结果第48页
        3.1 11 个目的片段的获取及其测序第48页
        3.2 整理测序结果第48页
    4 分析与讨论第48-50页
第四章 新城疫 Mukteswar 疫苗株各片段 cDNA 的组装第50-76页
    1 材料第50页
    2 方法第50-54页
        2.1 确定连接方案第50页
        2.2 Mukteswar 各片段 cDNA 的组装第50-54页
    3 结果第54-74页
        3.1 修改并确定连接方案第54-55页
        3.2 按照方案进行全长 cDNA 组装第55-74页
    4. 分析与讨论第74-76页
第五章 结论第76-77页
第六章 附录第77-101页
参考文献第101-109页
致谢第109-110页
攻读硕士学位期间发表文章第110页
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论文编号ABS548376,这篇论文共110页
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