近年来广受关注的CRISPR/Cas9系统,凭借着其能够通过RNA介导,精确靶向目的DNA并修饰的能力,极大的加强了人们对基因工程改造的能力。自2012年Jinek等人发现酿脓链球菌中的Type Ⅱ CRISPR/Cas系统中的Cas9蛋白能够通过RNA介导在试管中切割DNA之后的短短几年间,CRISPR/Cas9被广泛的运用于DNA突变、转录调控干预、表观遗传改造、染色体位点标记以及高通量的正向筛选中,取得了许多显著的成果。猪是一种重要的农业经济物种。除此之外,因为猪与人的解剖以及生理特征上的类似性,它还是生物医药研究中很好的动物模型以及临床上异种器官移植的理想供体。因此,对猪的基因改造具有意义重大的经济价值、研究价值以及临床应用价值。我们通过对中国巴马迷你猪的一细胞期的受精卵显微注射Cas9mRNA与sgRNA,成功的获得了Npc1l1敲除的个体。值得一提的是,Npc1l1位点的突变率达到了100%。同时,我们也在猪的各种组织以及卵巢组织中检测到了Npc1l1的突变,提示了突变能够通过生殖细胞传给下一代。CRISPR/Cas9的脱靶效应是一个不容忽视的生物安全性问题,尤其在经济物种改造以及临床应用方面脱靶很可能会产生危险。我们通过SeqMap工具在猪的基因组上选择了Npclll sgRNA相似度最高的8个潜在的脱靶位点,我们在检测中没有发现任何的脱靶效应。除了利用CRISPR/Cas9建立基因敲除猪以外,作为比较,我们还使用了TALEN建立B2m的敲除猪模型,并证实了其突变的可遗传。B2m敲除猪的细胞表面缺失MHC1复合物,其作为供体对小鼠进行皮肤移植时皮肤生存寿命显著延长,这为猪在将来作为异种器官移植的供体提供了进一步的可能性。我们除了利用CRISPR/Cas9系统做基因敲除之外,还尝试发掘dCas9在基因工程方面的作用。Qi等人证明了dCas9/sgRNA复合物在原核生物中通过结合在CDS区域对RNAP形成空间位阻从而阻断了转录延伸,起到抑制基因表达的效果。这提示我们可以利用dCas9/sgRNA复合物对靶位点的高度亲和性与反式作用因子竞争性的结合顺式作用元件,从而阻断两者结合后的功能。为了证明我们的假想,我们选择了人源的tet-on MAVS转基因293T细胞系,在DOX的诱导下高水平表达MAVS模拟病毒侵染,激活NF-κB、IRF3/7和cJun/ATF2,这些转录因子能够共激活IFNB1的表达从而启动细胞的抗病毒功能,是一条机制清晰的经典的信号通路。我们利用dCas9/sgRNA靶向结合上述转录因子在IFNB1启动子区的顺式作用元件,竞争性的阻止了转录因子对其的结合,达到阻断信号通路的目的,首次证明了CRISPR/Cas9技术可用于内源顺式作用元件的功能注释。这项研究成果为功能基因组学研究提供了新工具,同时也展示了CRISPR/Cas9技术在基因工程领域的又一应用方向。
