南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)是我国特有珍稀濒危树种,其基因组信息匮乏,分子遗传学研究相对滞后。目前,南方红豆杉可有效利用的分子标记数量极其有限,远不能满足遗传学和育种的研究要求。本研究以NCBI数据库中的4种红豆杉转录组序列为基础,利用生物信息学软件,开发南方红豆杉EST-SSR分子标记,检验多态性位点在红豆杉种间扩增情况,并将其应用于南方红豆杉父本分析。相关研究结果对红豆杉属物种保护和分子育种具有重要意义。主要研究结果如下:(1)分析了 4种红豆杉转录组序列特征。以NCBI数据库中4种红豆杉转录组序列为基础,利用生物信息学软件对转录组序列进行分析,分别得到南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)、东北红豆杉(Taxus cuspidata)、欧洲红豆杉(Taxus baccata)和曼地亚红豆杉(Taxus media)SSR位点2 344、2 361、1 357和2 312个。在2-6bp重复单元的微卫星中,南方红豆杉和曼地亚红豆杉以六核苷酸重复基元为主,其次为三核苷酸;东北红豆杉和欧洲红豆杉以三核苷酸为主,其次为六核苷酸。4种红豆杉,二核苷酸、三核苷酸、六核苷酸优势重复基序类型均为AG/CT、AAG/CTT、AAGAGG/CCTCTT。(2)开发得到112个红豆杉属多态性位点。以4种红豆杉位点信息为基础,选择重复单元数大于或等于9的位点合成150对引物。基因分型结果表明,112对引物具有多态性,多态性比率达到74.67%。其中,南方红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉和曼地亚红豆杉中各开发得到59、17、13和23个多态性位点。(3)开发得到103个南方红豆杉多态性位点。利用16个单株样本对103个EST-SSR位点进行遗传参数分析,共检测到462个等位基因,每位点等位基因数(Na)变化范围为2-11,平均每个位点的等位基因数为4.41。各位点观测杂合度(Ho)的变化区间为0-1,平均值为0.459;期望杂合度(He)的变化区间为0.0625-0.891,平均值为0.513;近交系数(FIS)的变化区间为-0.654-1,平均值为0.085。多态性信息含量(PIC)变化区间为0.059-0.849,平均多态性信息含量为0.453。14个位点存在无效等位基因(Oosterhout值),频率变化区间为0.135-0.470;22个位点偏离哈代-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)。(4)分析了 107个位点在5种红豆杉中的种间扩增情况。其平均扩增率为96.07%。其中,只有一个位点(Ma-25497-83A)没有扩增,4个位点(C-52641-193B,Ma-1402-721B,Ma-186-234D,Ma-6383-968B)的扩增率小于 50%,100 个位点的种间扩增率达到100%。(5)检验了开发位点的有效性和准确性。48株红豆杉样本的主成分分析(PCA)结果与种的分类相一致,6种红豆杉属的聚类分析结果与其它标记结果基本类似。(6)筛选10个多态性丰富的位点对三个南方红豆杉群体进行父本分析。CERVUS软件在95%的置信度可确定祁阳群体、攸县群体、八大公山群体的自由授粉父本各12个(占总子代的37.50%)、21个(占总子代的84.00%)、7个(占总子代的18.91%),三个群体候选父本的累积排除率分别达到了 98.32%,93.80%和97.40%。父本分析结果表明南方红豆杉有效花粉散布距离为10-25m。
