丹参(Salvia miltiorrihiza Bunge)为唇形科植物,入药部位为干燥根及根茎,全国多地均有出产。丹参在我国使用历史悠久,多部本草资料中均有记载。丹参有效成分分为脂溶性的萜醌类成分和水溶性的酚酸类成分。脂溶性主要成分有丹参酮、丹参酮ⅡA、隐丹参酮等,具有抗炎、抗心肌缺血等作用；水溶性部分主要成分有丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B等,具有抗心肌缺血作用。丹参有效成分含量高低与遗传背景和生长环境有密切的关系。其中四川中江作为丹参药材道地产区,其丹参资源具有良好的遗传背景。有多项研究表明,环境因子和丹参的生长及有效成分含量的高低之间具有显著的相关性,其中热胁迫是环境因子中影响较大的因子之一。在本研究中,采用组织培养及植物快繁技术,构建遗传背景一致的四川中江丹参群体,并模拟自然条件对丹参进行热胁迫,对热胁迫下丹参转录组变化及迷迭香酸途径和萜类合成途径关键酶进行了表达分析,为进一步研究热胁迫与有效成分积累的关系提供依据。主要结果如下：1.热胁迫对丹参转录组表达的影响：为研究丹参高温胁迫响应基因,使用cDNA-AFLP技术对中江丹参高温胁迫下叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。使用EcoR I和MseⅠ酶切组合,对38℃胁迫下,0、2、4、6、12、24、48小时丹参cDNA文库进行双酶切,通过预扩增和256对引物组合进行选择性筛选。共分离出196个差异表达转录衍生片段(TDFs),其中增强与诱导表达122条,抑制表达74条。对全部TDFs进行了回收、克隆、测序及序列分析。根据NCBI数据库鉴定出147个TDFs,涉及信号转导、转录调控、逆境响应蛋白等,49个TDFs为未知序列。使用Blast2go软件对所有TDFs进行Gene Ontology注释与分析,分别找到86个与细胞组分相关的TDFs,103个与分子功能相关的TDFs和98个与生物学作用相关的TDFS。其中找到了8个与激酶蛋白相关的基因序列,7个与Ca2+相关蛋白的基因序列,14个与转录相关蛋白的基因序列,13个与信号相关蛋白的基因序列和12个热激蛋白基因序列,这一系列基因序列的发现为进一步研究热胁迫下丹参信号传递、转录调控和逆境响应与次生代谢途径之间的关系奠定了基础,为解释热胁迫与有效成分合成与积累提供了依据。2.热胁迫对丹参迷迭香酸途径关键酶表达的影响：迷迭香酸途径是水溶性酚酸类成分合成的主要途径,热胁迫对丹参酚酸类成分的积累有重要的影响。对丹参幼苗进行38℃持续热胁迫,于0、2、4、6、12、24、48小时提取叶片RNA,使用定量RT-PCR法,以Actin与GAPDH作为内参基因,构建出PAL.C4H. 4CL、TAT、HPPD、HPPR和RAS 7个代谢途径关键酶基因0-48小时表达时序图谱。其中PAL.C4H和RAS受热胁迫影响,表达量下降;TAT、4CL和HPPD表达呈先上升后下降趋势,HPPR表达量前期变化不大,后期呈下降趋势。该表达时序谱的建立为进一步研究热胁迫与酚酸类成分累积之间的关系奠定了基础。3.热胁迫对丹参萜类合成途径关键酶表达的影响：萜类合成途径是脂溶性萜醌类成分合成的主要途径,热胁迫对丹参萜类类成分的积累有重要的影响。对丹参幼苗进行38℃持续热胁迫,于0、2、4、6、12、24、48小时提取叶片RNA,使用定量RT-PCR法,以Actin与GAPDH作为内参基因,构建出HMGR、DXs、DXR.CMK.IPPI.FPPS和GGPPS 7个代谢途径关键酶基因0-48小时表达时序图谱。其中萜类合成途径的前期关键酶基因,HMGR.DXS.DXR和CMK受热胁迫影响,表达量均呈现先上升后下降的趋势,DXR途径中的DXS.DXR和CMK的表达峰值呈现时序性,其顺序为DXS>DXR>CMK、推测底物浓度对其表达有诱导作用；萜类合成途径的中期关键酶基因,IPPI.FPPS和GGPPS受热胁迫影响,其表达量均表现出先下降后上升的趋势,但上升幅度因基因种类而各异,其中FPPS上升幅度最小,IPPI上升幅度居中,但均未超过胁迫前表达量,GGPPS上升幅度最大,超过了胁迫前表达量。该表达时序谱的建立为进一步研究热胁迫与萜醌类成分累积之间的关系奠定了基础。
