猪圆环病毒(Porcine circovirus),属于圆环病毒属成员,分为PCV1和PCV2两种基因型,其中,PCV2作为危害养猪业的重要病原之一,受到世界各国研究员人员的广泛关注。PCV2首次分离自加拿大断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)发病猪血清。但单独感染PCV2并不能引起典型的PMWS症状,需伴随PPV、PRV、PRRS等病毒混合感染,才可导致严重的临床症状及较高的死亡率。类猪圆环病毒P1,是研究者在检测临床疑似PMWS猪的样品过程中分离到的一种新病毒,该病毒仅含有648个核苷酸,其基因组结构与PCV2相似,同为环状闭合的DNA分子。而且,P1的基因组序列与PCV20RF2(Openreadingframe2)的序列有较高的同源性。随着对P1的病原学研究的不断深入,已有实验表明,P1双分子克隆病毒可引起转染的PK-15细胞发生凋亡,同时也可引起感染猪出现类似PMWS的症状。但目前P1病毒在临床上的流行情况及致病机理仍有待研究,对自然感染P1的发病猪病例的研究有助于阐明P1分子的临床致病特点及机理机制。因此,本研究对江苏等地P1的分子流行病学情况进行调查;通过PCR检测及分子克隆的方法得到了15条毒株的序列,并对其进行比对分析,同时,对自然感染P1并伴有严重神经震颤的仔猪病例进行了 P1病毒载量的检测工作及系列的病理学研究。本论文的主要研究内容如下:1、华东地区类猪圆环病毒P1的流行病学调查为了解华东地区类猪圆环病毒P1的流行特点,探究P1病毒的进化来源及其临床致病机理,本试验对2015-2016年间江苏、河北、安徽、浙江共4个省的百余家中小型规模猪场所收集的254份样品进行了 PCR检测。结果显示,254份样品中,有45份检测为P1阳性,感染率达到17.70%。表明这些地区的猪群中普遍存在P1的感染。阳性样品中,血清、脑、肺脏及淋巴结样品的检测率较高,分别达到38.46%、43.47%、11.00%、17.85%。同时,进行P1与猪常见病原CSFV、PRRSV、PCV2的混合感染分析,其混合感染率分别为4%、3%、20%、36%。克隆得到的15条P1序列与P1参考毒株(登录号为KJ612072.1)序列的同源性分析结果显示,来自不同省份的毒株序列同源性皆在95%以上,说明江苏省及周边地区各地P1流行毒株的地域性及变异性不显著。病毒的ORF1序列比对结果表明其同源性均在98%以上,这表明该阅读框序列较为保守。P1序列与PCV2不同基因亚型参考毒株的全基因组序列构建遗传进化树的结果显示,PCV2参考毒株China-BF与P1在同一个分支,PCV2三个基因亚型同在另一分支,说明P1在遗传学上与PCV2有较近的亲缘关系。因此研究者推测,作为一种新发现的猪病原,P1很可能是圆环病毒属的又一新成员,所以探索其遗传进化来源及研究其临床致病性具有重要的临床意义。2、自然感染类猪圆环病毒P1仔猪的病例研究为研究自然感染类猪圆环病毒P1同时伴有仔猪先天性震颤(CT)症状的仔猪病例,对自然感染P1的发病仔猪进行了系列的病原学检测及病理学分析。采用本实验室构建成功的real-time PCR的方法检测P1核酸在发病猪各组织中的分布,镜检观察分析心、肝、脾、肺、肾、胰、脑及淋巴结等组织的病理学变化,同时对脑组织进行免疫组织化学实验以定位检测病毒抗原的分布。另外,常见猪病原PCV2、PRRSV、CSFV的PCR检测结果显示皆为阴性。荧光定量检测P1在组织中的分布,结果显示,淋巴结组织中的病毒核酸含量最高,高达105拷贝/g,脑组织中含量次之,达到103拷贝/g左右,其余各组织的含量较低,均在102拷贝/g左右。这说明淋巴结和脑很可能是P1病毒复制的主要器官。组织病理学的观察结果发现,各脏器表现出不同程度的组织损伤,且出现炎性细胞浸润。其中淋巴结组织损伤较为严重,部分淋巴滤泡内淋巴细胞溶解消失;大脑组织表现为局部组织可见多处嗜神经细胞现象,少量胶质细胞增生,脑血管周围充血;小脑组织表现为部分浦肯野细胞缺失,核溶解;肾脏组织病变表现为肾小管上皮细胞发生溶解、坏死,并脱落至管腔,腔内伴有炎性渗出物,其余组织的病变不明显。对其中两头震颤较为严重仔猪的脑组织进行免疫组织化学实验,结果显示细胞质出现部分黄染,表明脑组织中有P1病毒抗原阳性信号。以上实验结果说明,发病猪的临床症状及各组织的损伤程度与P1核酸在组织中的病毒载量及病毒抗原定位检测结果基本符合,进而可以推测出,仔猪自然感染P1与出现先天性震颤有密切的关系,P1很可能是引起CT的又一种可能性病原,其具体致病机理还有待进一步研究。
