中成药疏血通对脊髓损伤的治疗作用脊髓夹伤后星形胶质细胞的形态变化及对增多的星形胶质细胞来源的初步探讨

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脊髓损伤(SCI)导致血管破裂、出血、炎性细胞渗出、水肿、血栓形成、血管痉挛等,这一系列的因素导致脊髓血流(SCBF)降低,最终引起缺血,缺血又可导致脊髓继发性损伤的产生。研究表明:脊髓缺血的严重程度与继发性损伤的严重程度具有显著的相关性。因此,如何改善SCI后的缺血状况,成为治疗SCI的一个重要研究热点。SXT是一种中成药,主要成分为水蛭素和蚓激酶,二者均具有强大的促血流作用,因此SXT常用来治疗淤血淤滞,在临床上常用来治疗缺血性疾病,如脑梗死和心肌梗死等,并取得了良好的临床效果,并且未出现不良反应。SXT能否促进SCI后SCBF的恢复,改善SCI导致的缺血状况,延缓脊髓继发性损伤至今尚未见报道。因此我们设计了以下实验来观察SXT对SCI的治疗作用。实验一,我们采用单宁酸—三氯化铁(Ta-Fe)媒染血管的方法,再结合HE或苏木素染色观察了脊髓挤压损伤后损伤区以及损伤边缘区血管的形变以及缺血情况。发现脊髓挤压伤后,存在两个区域:第一个区域靠近损伤中心,缺血较严重,神经元已经变性消失,属于不可被挽救区域;第二个区域离损伤中心较远,靠近第一个缺血区,该区域血管已萎缩变细,苏木素染色较正常区域苍白,神经元仍旧存在,该区域为可挽救区域。此外,我们对出血面积进行了统计学分析,发现在损伤后0 h和8 h出血面积最大,从损伤后24 h开始,出血面积减小。在实验二中,我们亦采用脊髓挤压损伤模型,在损伤后24 h开始给SCI大鼠尾静脉注射SXT,并用生理盐水作为对照,观察了SXT对SCI的治疗作用,结果如下:1、激光多普勒(LDF)测血流量实验显示:SXT能够促进SCI大鼠SCBF的恢复。SXT组大鼠SCBF在SCI 0.5 h时为57±6.43%,经SXT治疗后,到SCI 3 d时,SCBF恢复到了78±4.16%,与0.5 h SCBF相比,差异显著(P < 0.01),到SCI 7 d时,SCBF进一步恢复到了84±2.20%,与前两个时间点相比,亦有显著性增加(P < 0.05);生理盐水对照组在整个实验过程中,SCBF均没有显著性变化(SCI 0.5 h为58±6.20%,3 d时为65±3.81%,7 d时为61±6.68%,各时间点SCBF无显著性差异(P > 0.05)。2、Tarlov?s运动功能评分表明:SXT可显著增加SCI大鼠的运动功能评分。SCI即刻,生理盐水组和SXT组大鼠运动功能评分均为0;到SCI 7 d时,两组间已经出现显著性差别。生理盐水组大鼠仅出现髋关节和膝关节活动,评分为1.62±0.52,而SXT组大鼠此时已可支撑体重,评分为2.83±0.41,与生理盐水组大鼠相比,差异显著(P < 0.01);SCI 14 d时,SXT组大鼠功能继续恢复,前肢和后肢出现协调运动,功能评分为3.83±0.41,而生理盐水组大鼠恢复到可支撑体重,评分为2.67±0.52,显著低于SXT组(P < 0.01)。3、足迹实验显示:SXT能显著促进SCI大鼠运动步态的恢复。SCI 7 d时,生理盐水组大鼠足背拖地现象严重,几乎不能行走,而SXT组大鼠此时已经可以足底着地行走;SCI 14 d时,生理盐水组大鼠组恢复到可以足底着地行走,但足背拖地现象依然严重,而SXT组大鼠此时功能进一步恢复,足背着地现象几乎消失。统计学分析表明:与生理盐水组大鼠相比,在两个测量时间点SXT组足背拖地比率均显著降低,步长均显著增长,步宽均显著减小(P < 0.01)。4、HE染色和GFAP免疫组化染色均显示:SXT治疗后可缩小损伤区面积。SCI 14 d时,生理盐水组大鼠损伤区面积为4.01±0.81 mm2,SXT组损伤区面积为2.67±0.36 mm2,与生理盐水组相比,差异显著(P < 0.01)。此外,硫瑾染色显示:与生理盐水组大鼠相比,SXT组损伤旁区神经元较多,炎性细胞较少,组织结构保存较好。5、NeuN免疫组化染色显示:SXT治疗可保护损伤旁区神经元。SCI 14 d时, SXT组NeuN两个断端间的距离(1.95±0.38 mm)显著小于生理盐水对照组(2.57±0.25 mm)(P < 0.05);并且SXT组损伤旁区神经元为56±10.79,显著多于生理盐水组(37.2±9.60)(P < 0.05)。以上结果显示:SXT能促进SCBF的恢复,改善缺血区域的缺血状况,挽救缺血区的神经元,促进运动功能的恢复。星形胶质细胞是CNS的一种多功能细胞,对BBB或BSCB形成和维持、离子平衡、神经递质调节和传递、细胞外基质的产生均起着重要的作用。此外,它还能对各种损伤做出反应,参与组织修复和结构重塑。星形胶质细胞活化的标志是中间丝蛋白(GFAP &Vimentin)表达上调、胞体肿胀、突起增加、增殖、迁移,最终形成胶质瘢痕。脊髓机械性创伤后星形胶质细胞同样也会活化,形成胶质瘢痕,对SCI的病理变化和修复发挥各种有利和有害的作用。关于SCI后星形胶质细胞的形态变化已有很多文献报道,包括胞体肿胀、突起伸出等,但多数研究是利用GFAP免疫组化染色方法来观察星形胶质细胞的形态变化。我们在研究中发现:由于星形胶质细胞胞体较小,胞体的轮廓往往受到GFAP纤维状染色的影响而不能十分清楚地显示出来,给星形胶质细胞形态变化的观察带来一定的困难。因此通过对GFAP::GFP转基因小鼠的观察分析可以有效的解决上述问题。GFAP::GFP转基因小鼠是将GFAP基因的启动子和GFP编码序列相连接,构建转基因载体,随后建立的转基因小鼠。该小鼠的特点是:在CNS中,只有表达GFAP基因的细胞才表达绿色荧光蛋白(GFP)。由于星形胶质细胞高表达GFAP基因,因此星形胶质细胞的胞体和突起在蓝光激发下呈现出绿色荧光,这极大地方便了我们对星形胶质细胞形态的观察。因此,我们利用该小鼠观察了脊髓夹伤后星形胶质细胞随时间的形态变化情况;同时,我们还对脊髓夹伤后增多的星形胶质细胞的来源进行了初步探讨。在整个实验中,观察切面均为矢状切面。结果如下:1、在未损伤脊髓中,白质的星形胶质细胞胞体呈圆型或三角型,突起少而长,呈放射状排布;灰质中的星形胶质细胞胞体呈圆型,突起较短,也呈放射状排布。由于灰质中的星形胶质细胞较白质密集,因此在以下的损伤研究中,我们均选择灰质的星形胶质细胞进行观察,观察的主要部位为损伤区和正常区之间的损伤过渡区,以及损伤中心。2、在脊髓夹伤后3 d,损伤过渡区内的星形胶质细胞同未损伤脊髓组织内的星形胶质细胞相比,形态无明显变化;损伤中心区星形胶质细胞消失。3、在脊髓夹伤后7 d,损伤过渡区内出现了胞体伸长,呈梭形,同时突起伸出,并呈头尾方向极性排布的星形胶质细胞;损伤中心区尚未出现胶质瘢痕。4、在脊髓夹伤后14 d时,损伤过渡区内的星形胶质细胞形态与7 d组相似;而损伤中心区开始出现胶质瘢痕。5、在脊髓夹伤后21 d,损伤过渡区内仍然可以观察到胞体伸长,呈梭形;同时突起伸出,并呈头尾方向极性排布的星形胶质细胞;损伤中心区的胶质瘢痕较14 d组更加明显。6、在脊髓夹伤后28 d,损伤过渡区内胞体伸长,突起呈极性排布的星形胶质细胞减少,而胞体呈圆型,突起呈放射状排布的星形胶质细胞增多;同时损伤中心区的胶质瘢痕较前面4个时间点均明显增加,瘢痕中的星形胶质细胞胞体呈圆型,突起相互缠绕在一起。7、在脊髓夹伤后28 d内,可以清楚地观察到,随着夹伤后时间的推移,绿色的星形胶质细胞从头尾两端向脊髓损伤中心聚集,逐渐缩小脊髓损伤区面积。8、正常脊髓灰质中无硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)与GFP双标的细胞。损伤7 d时,在损伤过渡区内出现了NG2与GFP双标的细胞。
缩略语表第5-8页
第一部分 中成药疏血通对脊髓损伤的治疗作用第8-72页
    中文摘要第8-11页
    英文摘要第11-15页
    前言第15-18页
    文献回顾第18-27页
    正文第27-61页
        实验一 单宁酸三氯化铁法察脊髓损伤后血的变化与缺血第27-38页
            1 材料第28页
            2 方法第28-30页
            3 结果第30-36页
            4 讨论第36-38页
        实验二 中成疏血通对脊髓损伤的治疗作用第38-61页
            1 材料第39页
            2 方法第39-44页
            3 结果第44-57页
            4 讨论第57-61页
    小结第61-62页
    参考文献第62-72页
第二部分 脊髓夹伤后星形胶质细胞的形态变化及对增多的星形胶质细胞来源的初步探讨第72-124页
    中文摘要第72-75页
    英文摘要第75-78页
    前言第78-80页
    文献回顾第80-94页
    正文第94-109页
        1 材料第95页
        2 方法第95-98页
        3 结果第98-106页
        4 讨论第106-109页
    小结第109-110页
    参考文献第110-124页
个人简历和研究成果第124-125页
致谢第125-126页
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