目的:为研究脂毒性对肾脏的损伤作用,我们利用游离脂肪酸(Free Fatty Acids,FFAs)干预人近曲肾小管上皮细胞(HK-2),探讨游离脂肪酸对人近曲肾小管上皮细胞的影响及作用机制。方法:用含有不同浓度(0、125、250、500μmol/L)软脂酸的DMEM-F12培养人近曲肾小管上皮细胞(HK-2),在0h、24h、48h三个时段:①形态学观察;②油红O染色检测细胞内脂质;③MTT法检测不同环境下FFAs对HK-2细胞增殖的影响;④流式细胞术检测FFAs对细胞凋亡和细胞周期的影响;⑤免疫细胞化学法检测处理前后HK-2细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、凋亡相关蛋白caspase8蛋白、及白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)表达的变化。结果:①HK-2细胞形态正常HK-2细胞呈圆形贴壁细胞,铺满后,细胞融合呈鹅卵石状。经FFAs作用后,HK-2细胞由圆形变为拉长的梭形,细胞间的连接变松散。②油红O染色检测细胞内脂质沉积软脂酸干预组,48h后,HK-2细胞胞浆内出现了非常清晰的红染脂滴颗粒。而对照组HK-2细胞未见到红染脂滴颗粒。③MTT检测HK-2细胞增殖OD值随着软脂酸浓度的增加和作用时间的延长逐渐减小。三种不同剂量组之间两两比较均有统计学差异(P<0.05)。相同浓度时,24 h与48h组间比较高、中剂量组有统计学差异( P< 0.05) ,低剂量组无统计学差异(P>0.05)说明软脂酸抑制HK-2细胞增殖,并具有剂量和时间依赖性趋势。各软脂酸组与对照组比较有显著差异( P<0.01) ,d-BSA组和正常培养液组相比无统计学差异(p>0.05)。④流式细胞术测定结果FFAs作用48h时采用双标记法检测细胞凋亡,HK-2的凋亡率依次为5.86±1.39、9.61±0.82、12.3±1.19,与正常对照组2.23±0.92、d-BSA对照组2.64±1.02相比差异显著(P<0.05)。PI单标检测细胞周期的变化,与对照组细胞相比,组G0/G1比例增加,S期比例降低,与对照组差异显著(P<0.05)⑤细胞免疫化学法检测结果在正常对照组、d-BSA对照组培养,48h时,iNOS、caspase8、IL-1β、IL-8几乎不表达,两对照组之间无统计学差异(P>0.05)。不同浓度的FFAs处理HK-2细胞后,iNOS、caspase8、IL-1β、IL-8表达明显增高,且具有浓度依赖趋势,与正常对照组和d-BSA对照组比较,iNOS、IL-1β、IL-8中、高剂量组差异均有统计学意义,caspase8各剂量组差异均有统计学意义(P<0.05)结论:FFAs可导致肾小管上皮细胞内脂质沉积,有抑制肾小管上皮细胞增殖,可能通过阻滞细胞周期,促进其凋亡的作用,并且具有时间浓度依赖性。这种作用可能与FFAs通过激活HK-2内的iNOS,导致产生过量的NO有关,caspase8参与了其发生和发展的过程,同时炎性细胞因子IL-1β、IL-8表达增多,共同促进了肾小管上皮细胞的凋亡。
