本研究根据其他植物GME和ACT的氨基酸保守序列设计简并引物,通过RT-PCR结合RACE扩增技术,从柠条(Caragana korshinskii)叶片中分别克隆了一个编码GME和ACT的基因,命名为CkGME和CkACT。通过DNAMAN、DNAStar、Blast P分析以及蛋白质理化性质的分析,得出以下结论:1、GME基因cDNA全长1604bp,包含一个长度为1134bp的开放阅读框,编码377个氨基酸残基,相对分子量为42.6kDa ,总原子数5909 ,理论等电点为5.71 ,分子式为C1890H2922N514O569S21。5′非编码区长为351bp,3′非编码区长为94bp。Genbank登录号为FJ603689;2、ACT基因cDNA全长1607bp,包括一个长度为1134bp的开放阅读框,编码377个氨基酸残基,相对分子量为41.7 kDa,总原子数5845,理论等电点为5.31,分子式为C1853H2921N491O560S20。5`非编码区长为151bp,3`非编码区长为293 bp。Genbank登录号为FJ485727;3、柠条GME基因编码的氨基酸序列与玉米、日本水稻、金虎尾果、葡萄、拟南芥、大豆、截型苜蓿和马铃薯等植物GME基因编码的氨基酸序列同源性分别为92%、90%、91%、92%、91%、95%、93%和91%,各种植物氨基酸数均在376到380之间,除了N末端有较大差异外,其余区域都比较保守;4、柠条ACT基因编码的氨基酸序列与玉米、水稻、裸燕麦、拟南芥、烟草、绿豆、豌豆、鹰嘴豆、截型苜蓿和红三叶等植物的ACT基因编码的氨基酸序列的同源性分别为97%、96%、96%、96%、97%、98%、97%、96%、99%和95%,各种植物氨基酸数均为376;5、柠条GME基因编码的蛋白质不稳定指数估算值为40.47,属于不稳定蛋白类;柠条ACT基因编码的蛋白质不稳定指数估算值为35.02,属于稳定蛋白类;6、以柠条ACT基因作为内参基因,用半定量RT-PCR的方法对GME基因在冷胁迫和GA3处理下的表达情况进行分析,结果显示:该基因在4℃处理1、2、4、和8h后,表达量没有明显变化;在100μmol/L GA3分别处理0,1,2,4,8,12,24h后,表达量均下降;7、PCR扩增CkGME编码区,构建pCAMBIA1300-GME重组质粒,将其转化农杆菌,PCR和BamHⅠ/SalⅠ双酶切鉴定结果显示:植物超表达载体pCAMBIA1300-GME已构建成功。
