视网膜缺血在青光眼、糖尿病视网膜病变等众多眼部疾病的发病机制中都发挥重要作用,目前临床上的治疗手段尚不理想。在缺血早期,过高浓度的谷氨酸是触发一系列损伤性级联反应的关键因素之一。而谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是清除突触间隙中过量谷氨酸的关键蛋白之一,对于防止兴奋性氨基酸毒性的产生具有重要作用。跨角膜电刺激(Transcorneal electrical stimulation, TES)在一些动物模型和临床研究中都初步显示了良好的神经保护效果,且副作用小,作为一种有潜力的神经保护方法逐步引起了眼科学者的关注。但其发挥具体疗效及作用的机制尚需进一步研究。本研究目的是在由前房灌注构建的大鼠视网膜缺血-再灌注模型上探讨TES对视网膜神经元缺血性损伤的保护效果,及对GS表达产生的影响。通过存活RGCs数目计数,视网膜组织学分析和ERG等方法从形态及功能上评价TES对神经元的保护效果；用免疫组织化学和Western blot的方法观察视网膜缺血后在TES干预下GS的表达水平,初步探究TES发挥神经保护作用的分子机制。第一部分跨角膜电刺激对大鼠视网膜神经元缺血性损伤保护作用的评估目的评价TES对视网膜神经元缺血性损伤形态和功能的保护作用方法选取成年雌性SD大鼠为研究对象,分为3组,正常组,假刺激组(电流为0μA,1小时/次),TES组(300μA,1小时/次)。视网膜缺血模型通过前房灌注(120mmHg,1小时)构建,造模后立刻给予两天一次的TES,直至14天。造模后7天、14天后通过视网膜铺片计数荧光金逆标的存活神经节细胞,用石蜡切片分析视网膜各层厚度,用暗适应视网膜电图(ERG)评价视网膜功能。结果视网膜铺片显示,正常大鼠视网膜的RGCs平均密度是2365±60(个/mm2)。缺血后第7天,假刺激组是1477±60 cells/mm2, TES组是1785±59 cells/mm2;第14天假刺激组是1147±56 cells/mm2,TES组是1414±52 cells/mm2。各时点TES组RGCs的密度与假刺激组有统计学差异(P<0.01)。石蜡切片视网膜厚度分析显示,正常大鼠内界膜到外界膜(ILM-OLM),内丛状层(IPL),外核层(ONL)的平均厚度分别为174.3±3.9μm,43.6±0.6μm,58.1±1.0μm。缺血后第7天,ILM-OLM相对正常的平均厚度,假刺激组是86.0%,TES组是96.0%；IPL相对正常的平均厚度,假刺激组是80.9%,TES组是93.1%；ONL相对正常的平均厚度,假刺激组是84.4%,TES组是97.3%。缺血后第14天,ILM-OLM相对正常的平均厚度,假刺激组是84%,TES组是92.9%；IPL相对正常的平均厚度,假刺激组是77.9%,TES组是89.1%；ONL相对正常的平均厚度,假刺激组是82.4%,TES组是93.6%。统计学分析显示,缺血后第7天、14天,TES组ILM-OLM (P＜0.05), IPL (P＜0.01), ONL (P<0.01)的平均厚度均显著高于假刺激组。ERG b波振幅统计学分析显示,缺血后7天TES组的b波振幅显著高于假刺激组,并在第14天出现了明显恢复(P<0.05)。结论TES对视网膜神经元缺血性损伤后的形态和功能都有良好的保护作用。第二部分跨角膜电刺激对大鼠视网膜缺血后谷氨酰胺合成酶表达的影响目的研究TES对大鼠视网膜缺血模型谷氨酰胺合成酶表达水平的影响,初步探讨TES发挥神经保护作用的机制。方法选取成年雌性SD大鼠为研究对象,分为3组,正常组,假刺激组(电流为0gA,1小时／次),TES组(300μA,1小时／次)。视网膜缺血模型通过前房灌注(120mmHg,1小时)构建,造模后立刻给予两天一次的TES,直至14天。造模后6小时、24小时、3天、7天、14天通过免疫组织化学在相同激光共聚焦显微镜条件下比较TES组与假刺激组GS的荧光强度和空间分布的差别,进一步用Western blot比较两组GS的表达水平的不同。结果免疫组织化学和Western blot分析均显示GS在TES的作用下表达水平明显增加,并且至少持续7天。结论TES能增加缺血后视网膜Muller细胞上GS的表达水平,这可能降低谷氨酸浓度,从而减轻谷氨酸介导的兴奋性氨基酸毒性,实现对视网膜神经元的保护作用。
