色素万寿菊psy双边界载体及遗传转化体系建立和SSR-PCR体系的优化
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万寿菊(Tagetes erecta L.)不仅是重要的园林花卉,具有极高的观赏价值,而且花是提取叶黄素的优质材料,具有很高的经济价值。本研究以色素万寿菊雄性不育两用系为材料,根据gus基因瞬时表达的情况,建立根癌农杆菌介导的以万寿菊下胚轴为外植体的遗传转化体系,通过分子标记和PCR技术,对色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR体系进行优化,同时构建叶黄素代谢途径中关键酶基因psy的双边界表达载体,为获得高叶黄素含量的万寿菊转基因品种奠定基础,本研究结果如下:(1)建立了色素万寿菊雄性不育两用系遗传转化体系。根据gus基因瞬时表达的情况,优化了遗传转化条件,建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。遗传转化的最佳条件为:外植体为下胚轴,预培养2d,农杆菌浓度OD600=1.0,1/2MS0悬浮,1/2MS0悬浮液和共培养培养基中AS浓度为100μmol/L,侵染采用80W、5min的超声波处理后,黑暗共培养2 d。(2)构建了叶黄素生物合成途径中关键酶基因psy的双边界载体。提取万寿菊花总RNA,RT-PCR获得cDNA,根据GenBank中万寿菊psy的编码序列设计特异引物,PCR扩增psy将其连接到双边界载体上,从而得到了植物表达载体,并采用“冻融法”将重组质粒转入农杆菌EHA105菌株中。(3)对色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR体系进行优化。以色素万寿菊雄性不育两用系为材料,通过对SSR-PCR反应体系中的主要因素dNTPs、引物及模板DNA进行最优条件筛选,建立了适合于色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR反应体系:2.5μl10×buffer、40 ng模板DNA、2μl 10μM/μl引物、1.0 U Taq酶、1.2μl2.5mM/μl dNTP,ddH2O补足体系至25μl;PCR循环程序为:94℃预变性2 min; 38个循环(94℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸1min),72℃延伸10 min。
摘要 | 第6-8页 |
ABSTRACT | 第8-9页 |
缩略词表 | 第12-14页 |
第1章 文献综述 | 第14-25页 |
1.1 万寿菊概述 | 第14-17页 |
1.1.1 万寿菊的形态特征 | 第14页 |
1.1.2 万寿菊生长习性 | 第14页 |
1.1.3 万寿菊的应用与功能 | 第14-17页 |
1.1.4 万寿菊品种选育进展 | 第17页 |
1.2 菊科植物遗传转化体系研究进展 | 第17-19页 |
1.2.1 外植体的选择对转化的影响 | 第18页 |
1.2.2 菌液浓度和AS 浓度对转化的影响 | 第18-19页 |
1.3 叶黄素代谢途径中关键酶基因psy 的研究进展 | 第19-20页 |
1.4 双边界载体构建的研究进展 | 第20-21页 |
1.5 SSR 分子标记的研究进展 | 第21-23页 |
1.5.1 SSR 在植物上的研究进展 | 第21-22页 |
1.5.2 SSR 在菊科植物上的研究进展 | 第22页 |
1.5.3 SSR-PCR 体系优化的研究进展 | 第22-23页 |
1.6 本研究的目的和意义 | 第23-25页 |
第2章 色素万寿菊遗传转化体系的初步建立 | 第25-35页 |
2.1 材料与试剂 | 第25-26页 |
2.1.1 植物材料 | 第25页 |
2.1.2 常用试剂及配法 | 第25页 |
2.1.3 常用培养基的配制 | 第25-26页 |
2.2 方法 | 第26-29页 |
2.2.1 万寿菊无菌苗培养 | 第26页 |
2.2.2 农杆菌菌液制备 | 第26-27页 |
2.2.3 遗传转化体系的建立 | 第27-28页 |
2.2.4 gus 组织化学染色 | 第28-29页 |
2.3 结果与分析 | 第29-33页 |
2.3.1 无菌苗种子灭菌结果 | 第29页 |
2.3.2 遗传转化体系的建立结果 | 第29-33页 |
2.4 讨论 | 第33-35页 |
第3章 万寿菊psy 基因植物双边界表达载体的构建 | 第35-50页 |
3.1 材料与试剂 | 第35-36页 |
3.1.1 植物材料 | 第35页 |
3.1.2 菌株及载体 | 第35页 |
3.1.3 酶与试剂盒 | 第35页 |
3.1.4 常用试剂 | 第35-36页 |
3.1.5 常用培养基的制备 | 第36页 |
3.2 方法 | 第36-43页 |
3.2.1 万寿菊取样 | 第36页 |
3.2.2 万寿菊花RNA 的提取和检测 | 第36-37页 |
3.2.3 万寿菊cDNA 的制备 | 第37-38页 |
3.2.4 PCR 扩增添加酶切位点的目的基因片段 | 第38页 |
3.2.5 凝胶电泳条带和酶切产物的柱层析纯化回收 | 第38-39页 |
3.2.6 DNA 回收片段与载体的连接 | 第39页 |
3.2.7 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl2 法) | 第39-40页 |
3.2.8 连接目的DNA 的载体转化DH5α感受态细胞 | 第40页 |
3.2.9 植物双边界表达载体的构建 | 第40-42页 |
3.2.10 植物表达载体转化根癌农杆菌 | 第42-43页 |
3.3 结果与分析 | 第43-48页 |
3.3.1 RNA 提取及检测 | 第43页 |
3.3.2 PCR 产物的扩增结果 | 第43页 |
3.3.3 阳性克隆的筛选 | 第43-45页 |
3.3.4 质粒提取及质粒酶切 | 第45-47页 |
3.3.5 重组质粒阳性克隆的筛选 | 第47页 |
3.3.6 根癌农杆菌工程菌株 | 第47-48页 |
3.4 讨论 | 第48-50页 |
第4章 万寿菊SSR-PCR 体系优化 | 第50-60页 |
4.1 实验材料 | 第50-52页 |
4.1.1 植物材料 | 第50页 |
4.1.2 引物 | 第50-51页 |
4.1.3 常用试剂与配置 | 第51-52页 |
4.2 SSR-PCR 体系优化 | 第52-55页 |
4.2.1 总DNA 提取 | 第52-53页 |
4.2.2 退火温度的筛选 | 第53页 |
4.2.3 PCR 扩增条件优化 | 第53-55页 |
4.2.4 8%非变性聚丙烯凝胶电泳检测 | 第55页 |
4.2.5 银染 | 第55页 |
4.3 结果与分析 | 第55-58页 |
4.3.1 总DNA 质量检测 | 第55-56页 |
4.3.2 退火温度选择 | 第56页 |
4.3.3 SSR 优化结果 | 第56-58页 |
4.3.4 15 对引物在优化的SSR-PCR 反应体系上的扩增效果 | 第58页 |
4.4 讨论 | 第58-60页 |
第五章 参考文献 | 第60-68页 |
致谢 | 第68-69页 |
攻读学位期间发表的学术论文 | 第69页 |
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