研究背景和目的花生四烯酸(arachidonic acid, AA)在生物体内的含量非常丰富,是机体内很多重要的生物活性物质的前体,间接影响着体内许多重要的生物学功能。花生四烯酸主要结合于细胞膜内侧脂肪酸上,当受到外界生理因素刺激时经磷脂酶A2水解释放到胞浆中。花生四烯酸的两条代谢途径环氧化酶和脂氧化酶早已为人们熟知。近年来,有研究者发现了花生四烯酸的第三条代谢途径,花生四烯酸细胞色素P450(Cytochrome P450, CYP)代谢途径。通过此途径,花生四烯酸被细胞色素P450表氧化酶代谢成四种不同的环氧一二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids, EETs) (1),分别为5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET和14,15-EET。可溶性环氧化酶水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)是EETs代谢的主要酶类之一,可将EETs代谢为生物活性明显减弱的二羟基一20碳三烯酸(Dihydroxyeicosatrienoic acids, DHET).国内外许多学者的研究证明,EETs在调节心血管系统稳态中发挥重要作用。EETs有强大的舒血管功能,机制是通过激活BKca2+引起血管平滑肌细胞超极化而导致血管舒张,另外还可通过激活eNOS,促进NO释放发挥作用；EETs可促进内皮细胞增殖与新生血管形成,其机制可能是通过激活MAPK与PI3K/AKT信号通路。EETs可以抑制TNF-α诱导的内皮细胞凋亡,其机制可能是通过抑制MAPK去磷酸化,及激活PI3K/AKT信号通路。EETs还可以抑制炎症保护血管内皮细胞。同时有大量实验证明,sEH抑制剂对心血管及其他系统具有明显的保护作用。sEH基因敲除可显著增加EETs,降低基因敲除动物收缩压；sEH基因突变与冠心病关系密切；在心肌-缺血再灌注实验中,sEH敲除动物的心功能迅速恢复,心肌梗死面积缩小,延缓缺血导致的心力衰竭和心律失常,其机制可能是通过激活P13K通路和心肌K+通道。sEH抑制剂可抑制心肌肥厚和保护心室重构。sEH基因突变与冠状动脉粥样硬化关系密切,sEH抑制剂可以改善血管重构,抑制血管炎症反应。糖尿病(Diabetes mellitus, DM)的发病率逐年增多,目前全球已经有超过2.25亿人患有糖尿病,糖尿病所导致的心脑血管系统和肾脏等并发症也明显增多。糖尿病的主要病理生理进程是高糖血症和胰岛p细胞功能障碍。其中p细胞损伤和功能障碍是糖尿病发生发展的主要因素,保护p细胞及改善其功能是控制糖尿病的重要策略。在本研究中,我们假设过表达CYP2J2基因,并联合可溶性环氧化酶水解酶抑制剂作用,可增加EETs的产量,改善葡萄糖稳态,抑制胰岛细胞凋亡,延缓DM进展。因此,在2型糖尿病KKAy小鼠模型中,研究CYP2J2基因治疗及与可溶性环氧化酶水解酶抑制剂联合作用后对葡萄糖稳态和胰岛细胞凋亡的影响及可能的分子机制,旨在从动物水平明确CYP2J2-EETs-sEH系统是否能预防和逆转胰岛细胞凋亡,进一步明确CYP2J2-EETs-sEH系统是否能够延缓2型糖尿病进展。实验方法1.采用三质粒共转染法包装重组腺相关病毒,sEH抑制剂1-adamantyl-3-cycloexylurea(2), trans-4-[4-(3-adamantan-l-ylureido)v cyclohexyloxy]-benzoic acid (sEHI-1471)由Dr. Hammurg友情馈赠；2.动物分组：选用年龄在10-11周的雄性肥胖型自发性2型糖尿病KKAy小鼠40只,雄性普通C57BL/6J小鼠10只。适应性喂养1周后,KKAy小鼠被随机分为4组：生理盐水处理组,rAAV-GFP组,rAAV-2J2组和rAAV-2J2+sEHI组;C57BL/6J小鼠为正常对照组,每组10只。根据不同组别在用小鼠固定器固定后,经尾静脉注射分别给予生理盐水,rAAV-GFP, rAAV-2J2病毒尾静脉注射,病毒量为1×1012pfu/只rAAV-2J2+sEHI组在注射rAAV-2J2病毒的同时每日给予sEHI-1471 (8mg/L)口服,持续服用12周。正常对照组不做任何处理。所有实验动物操作程序符合NIH实验动物管理与使用指南,及中国科学院实验动物管理规范所制定的标准；3.在干预前及干预后1、2、4、8和12周,5组小鼠分别抽血并用相关方法检测空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度胆固醇和高密度胆固醇水平。每周测量体重。实验结束前一天,代谢笼留取24小时尿,实验完成后处死动物,留取血液标本,ELISA方法检测血浆胰岛素和游离脂肪酸(FFA)含量。取胰腺,肝脏,肾脏等组织放入液氮冷冻后转入一80℃低温冰箱保存备用。同时以上部位的部分组织放入4%甲醛溶液中过夜固定,脱水浸蜡石蜡包埋后室温保存备用；4.应用腹腔注射葡萄糖耐量实验检测CYP2J2过表达及与sEHI-1471联合作用后对KKAy小鼠葡萄糖稳态的影响；5. ELISA试剂盒检测尿中14,15-DHET的含量；6.胰腺组织切片免疫荧光和H&E染色,TUNEL法检测胰岛细胞凋亡；7.应用Western blot的方法检测小鼠胰腺、肝脏及肾脏中CYP2J2蛋白的表达；检测KKAy及C57BL/6J小鼠胰腺中Bax、Bcl-2、Bcl-xL、pBad、Bim、Bid、p-Y473-AKT、p-Y989-IRS-1 and p-S307-IRS-1的表达。实验结果1. Western blot检测结果示,与正常对照组、注射生理盐水和rAAV-GFP的小鼠比较,注射rAAV-CYP2J2的两组小鼠胰腺,肝脏和肾脏的CYP2J2表达量显著增加(P<0.05); ELISA检测结果显示,rAAV-2J2组的14,15-DHET的含量是(24.33±1.85) ng/mL明显高于rAAV-GFP组(6.76±0.93) ng/mL,生理盐水组(6.13±0.74) ng/mL和正常对照组(5.7±0.31) ng/mL (P<0.05); rAAV-2J2+sEHI组14,15-DHET (17.18±1.52) ng/mL含量明显高于rAAV-2J2组(P<0.05)。2.所有小鼠的饮食量在实验过程中均无明显改变(6.5 g/day KKAy小鼠vs.5.8 g/day C57BL/6J小鼠)。生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠体重随实验进展不断增加,rAAV-2J2处理8周后可显著减少小鼠体重增加(p<0.05),之后小鼠体重无明显改变；与sEHI联合作用4周后即可显著减少小鼠体重增加,且直到实验结束,小鼠体重皆无明显增加(P<0.05)。生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠空腹血糖随实验进程不断增加,rAAV-2J2干预4周后,血糖相对于干预前降低～4mm/l (P<0.05)。与sEHI联合作用1周后相对于Saline组和rAAV-GFP组小鼠空腹血糖显著降低。两组小鼠降糖作用均可持续到实验结束。相对于C57BL/6J正常对照组,KKAy小鼠血甘油三酯(Tg)和总胆固醇(CHO)含量显著上升,血低密度胆固醇和高密度胆固醇含量无明显改变,1AAV-2J2或rAAV-CYP2J2+sEHI处理对上述血脂4指标无明显影响(P>0.05)。实验结束时血清检测显示,相对于正常对照组,生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠血胰岛素和游离脂肪酸(FFA)含量显著增加,rAAV-2J2处理能显著降低血胰岛素和游离脂肪酸含量,而与sEHI共同作用显著增强rAAV-2J2的降胰岛素和降游离脂肪酸作用。3.腹腔注射葡萄糖耐量实验结果显示,与C57BL/6小鼠0、30、60、120 min血糖浓度(4.68±2.17) mmol/L、(14.17±1.56) mmol/L、(8.89±1.63) mmol/L、(5.19±1.74) mmol/L相比较,4组KKAy小鼠的葡萄糖负荷之前空腹血糖的水平与葡萄糖负荷之后血糖的水平均显著升高(P<0.05)；然而,结果显示在rAAV-2J2处理组小鼠0、30、60、120min血糖浓度(10.56±2.2) mmol/L、(28.54±1.8) mmol/L、(21.88±2.3) mmol/L、(15.32±1.25) mmol/L, rAAV-2J2+sEHI处理组小鼠相应时间点血糖浓度(7.71±23.84) mmol/L、(23.84±1.81) mmol/L、(15.33±2.05) mmol/L、(12.08±1.87) mmol/L明显低于生理盐水组(13.22±2.1) mmol/L、(39.54±2.39) mmol/L、(32.46±1.71)mmol/L、(25.62±2.16)mmol/L(P<0.05)和rAAV-GFP组(12.56±2.31) mmol/L、(38.07±2.51)mmol/L、(31.24±1.86)mmol/L、(25.13±2.28)mmol/L (P<0.05)。曲线下面积(Area under the curve, AUC)计算提示,相对于正常组,生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠曲线下面积明显上升,而rAAV-2J2处理后曲线下面积明显下降,rAAV-2J2+sEHI的联合作用后曲线下面积相对于rAAV-2J2注射组有明显下降,显示sEHI与rAAV-2J2联合作用降糖能力得到显著增强。糖耐量实验中与血糖的变化情况相似,0、30、60、120分钟的胰岛素分泌量相对于C57BL/6J小鼠,KKAy小鼠的葡萄糖负荷之前空腹胰岛素的水平与葡萄糖负荷之后胰岛素的水平均显著升高(P<0.05);然而,实验结果显示在0、30、60、120分钟,rAAV-2J2组,rAAV-2J2+sEHI组血胰岛素浓度明显低于生理盐水组和rAAV-GFP组且差异有显著意义(P<0.05)。其中rAAV-2J2+sEHI组小鼠各时间点胰岛素分泌量均明显低于rAAV-2J2组小鼠各时间点胰岛素分泌量。4.胰腺组织形态和细胞凋亡：苏木素-伊红染色提示相对于正常组,生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠β细胞团块明显缩小,胰岛结构紊乱,边界模糊,rAAV-2J2处理能显著改善这些形态变化,与sEHI共同作用后胰岛形态基本恢复正常。相对于正常组,在生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠,免疫荧光胰岛素染色阳性细胞数目明显减少(p<0.05)而胰高血糖素染色阳性细胞明显增多(p<0.05)。rAAV-2J2能显著增加胰岛素染色阳性细胞数,与sEHI共同作用后效应更明显。TUNEL染色提示相对于正常对照组,生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠胰岛细胞染色阳性数目明显增多(p<0.05)。rAAV-2J2能显著减少胰岛凋亡细胞数胰岛细胞染色阳性数目,和sEHI的共同作用后这种保护效应更明显。5. Western blot检测结果显示,与C57BL/6J小鼠相比较,生理盐水组和rAAV-GFP组小鼠胰腺组织中p-Y989-IRS-1, p-Y473AKT, Bcl-2, Bcl-xL和pBad表达水平显著减少而p-S307-IRS-1, Bax, Bim和Bid表达水平显著增加。CYP2J2蛋白过表达显著阻止胰腺组织中p-Y989-IRS-1, p-Y473AKT, Bcl-2, Bcl-xL和pBad表达水平减少(p<0.05)的同时显著阻止了p-S307-IRS-1, Bax, Bim和Bid表达水平增加(P<0.05)。统计学分析所有数据均以均数士标准误表示,应用SPSS13.0软件进行统计学分析,各分组组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异具有统计学显著性意义。结论1.重组腺相关病毒介导的CYP2J2基因转染成功在KKAy小鼠体内表达,并发挥其作用将花生四烯酸代谢为EETs, sEHI共同作用使EETs产量增加。2. CYP2J2基因过表达及与sEHI共同作用显著减少KKAy小鼠体重增加,降低血糖,血胰岛素和游离脂肪酸.3. CYP2J2基因过表达及与sEHI共同作用改善KKAy小鼠葡萄糖稳态和胰岛素分泌量4. CYP2J2基因过表达及与sEHI共同作用可改善KKAy小鼠胰岛形态,增加胰岛素染色阳性细胞数,减少胰岛细胞凋亡数。5. CYP2J2基因过表达及与sEHI共同作用可抑制胰岛细胞凋亡,其分子机制可能是激活了IRS-1/Akt信号通路及Bcl-2家族相关蛋白。6.本实验的研究成果为将来研究胰岛细胞凋亡与制定糖尿病的防治新策略,寻找新的药物作用靶点,开发新的研究药物提供了新的研究方向和理论依据。
