中文摘要 | 第3-5页 |
Abstract | 第5-7页 |
文献综述 | 第11-19页 |
1 草莓镶脉病毒的研究概况 | 第11-14页 |
1.1 草莓镶脉病毒的分布与危害 | 第11页 |
1.2 草莓镶脉病毒侵染寄主后的症状 | 第11页 |
1.3 草莓镶脉病毒的寄主及传播途径 | 第11-12页 |
1.4 草莓镶脉病毒的基因组结构、功能及变异 | 第12-14页 |
2 病毒与植物寄主的互作 | 第14-16页 |
2.1 植物寄主对病毒的防御反应 | 第14-15页 |
2.2 病毒对寄主植物防御反应的应答 | 第15-16页 |
3 病毒的致病性相关因子 | 第16-19页 |
引言 | 第19-21页 |
材料与方法 | 第21-38页 |
1 供试材料 | 第21页 |
1.1 病样来源 | 第21页 |
1.2 植物材料 | 第21页 |
1.3 菌种和载体 | 第21页 |
1.4 酶和化学试剂 | 第21页 |
1.5 常用缓冲溶液和培养基 | 第21页 |
1.6 抗生素 | 第21页 |
1.7 仪器设备 | 第21页 |
2 试验方法 | 第21-38页 |
2.1 叶片总 DNA 的提取 | 第21-22页 |
2.2 叶片总 RNA 的提取 | 第22-23页 |
2.2.1 提 RNA 的准备工作 | 第22页 |
2.2.2 Trizol 抽提液提取总 RNA 方法 | 第22-23页 |
2.3 cDNA 的合成 | 第23页 |
2.4 PCR 技术 | 第23-24页 |
2.5 PCR 产物的克隆 | 第24-27页 |
2.5.1 PCR 产物回收和纯化 | 第24页 |
2.5.2 PCR 产物的连接 | 第24-25页 |
2.5.3 感受态细胞的制备 | 第25页 |
2.5.3.1 Ecoli DH5 α感受态细胞的少量制备(CaCl2法) | 第25页 |
2.5.3.2 农杆菌感受态细胞的少量制备 | 第25页 |
2.5.4 连接产物的转化 | 第25-26页 |
2.5.4.1 连接产物转化大肠杆菌 | 第25-26页 |
2.5.4.2 连接产物转化农杆菌(冻融法) | 第26页 |
2.5.5 阳性克隆的 PCR 鉴定 | 第26页 |
2.5.6 质粒提取 | 第26-27页 |
2.6 重组质粒的鉴定 | 第27页 |
2.7 克隆基因的测序、分析和登录 | 第27页 |
2.8 SVBV P6 基因的克隆及序列分析 | 第27-29页 |
2.8.1 扩增 SVBV 中国分离物 P6 基因的引物设计 | 第27-28页 |
2.8.2 扩增 SVBV 美国分离物 P6 基因的引物设计 | 第28页 |
2.8.3 SVBV 中国分离物 P6 基因的 PCR 扩增 | 第28页 |
2.8.4 SVBV 美国分离物 P6 基因的 PCR 扩增 | 第28页 |
2.8.5 SVBV P6 基因序列相似性分析 | 第28-29页 |
2.8.6 SVBV P6 基因序列结构分析 | 第29页 |
2.9 植物表达载体的构建策略 | 第29-30页 |
2.9.1 瞬间表达 SVBV P6 基因及其缺失突变体植物表达载体的构建策略 | 第29-30页 |
2.9.2 转基因 SVBV P6 基因植物表达载体的构建策略 | 第30页 |
2.10 植物表达载体的构建过程 | 第30-33页 |
2.10.1 扩增 SVBV P6 基因的引物设计与合成 | 第30-31页 |
2.10.2 扩增 SVBV P6 基因缺失突变体引物设计与合成 | 第31-32页 |
2.10.3 SVBV P6 基因及其缺失突变体基因的克隆 | 第32-33页 |
2.10.4 SVBV P6 基因及其缺失突变体基因植物表达载体的构建 | 第33页 |
2.10.5 重组植物表达载体导入农杆菌 | 第33页 |
2.11 瞬间表达接种本氏烟 | 第33-34页 |
2.12 瞬间表达烟草的 RT-PCR 检测 | 第34-35页 |
2.13 半定量 RT-PCR | 第35页 |
2.14 植物可溶性蛋白样品的制备 | 第35页 |
2.15 SDS-PAGE | 第35页 |
2.16 Western Blot 分析 | 第35-36页 |
2.17 植物病毒的 ELISA 检测 | 第36页 |
2.18 烟草转化及卡那霉素抗性植株的获得 | 第36-37页 |
2.19 转基因烟草阳性植株的检测 | 第37-38页 |
结果与分析 | 第38-51页 |
1 SVBV P6 基因的克隆及序列分析 | 第38-40页 |
1.1 SVBV 中国分离物 P6 基因的 PCR 扩增 | 第38页 |
1.2 SVBV 美国分离物 P6 基因的 PCR 扩增 | 第38页 |
1.3 SVBV P6 基因阳性克隆的筛选 | 第38-39页 |
1.4 SVBV P6 基因的序列分析 | 第39-40页 |
2 SVBV P6 基因植物表达载体的构建 | 第40-43页 |
2.1 瞬间表达植物表达载体的构建 | 第40-42页 |
2.1.1 SVBV P6 基因阳性克隆的获得 | 第40页 |
2.1.2 pGR-CH P6 和 pGR-US P6 植物表达载体的构建 | 第40-41页 |
2.1.3 SVBV P6 突变体基因(△P6)的克隆 | 第41页 |
2.1.4 pGR-△CH P6 和 pGR-△US P6 植物表达载体的构建 | 第41-42页 |
2.2 转基因植物表达载体的构建 | 第42-43页 |
2.2.1 SVBV 中国分离物 P6 基因的克隆 | 第42页 |
2.2.2 pCAM-CH P6 植物表达载体的构建 | 第42页 |
2.2.3 SVBV 美国分离物 P6 基因的克隆 | 第42页 |
2.2.4 pCAM-US P6 植物表达载体的构建 | 第42-43页 |
3 瞬间表达本氏烟的症状表型及相关检测 | 第43-47页 |
3.1 瞬间表达本氏烟的症状表型 | 第43-45页 |
3.2 瞬间表达 PVX 病毒载体片段的 RT-PCR 检测 | 第45页 |
3.3 瞬间表达 P6 基因的 RT-PCR 检测 | 第45-46页 |
3.4 瞬间表达本氏烟 P6 基因半定量 RT-PCR 检测 | 第46页 |
3.5 瞬间表达本氏烟中 PVX 复制量的 ELISA 检测 | 第46-47页 |
4 转基因烟草阳性植株的获得、分子检测及症状表型 | 第47-50页 |
4.1 转基因烟草的获得 | 第47-49页 |
4.2 转基因烟草植株的分子检测 | 第49页 |
4.3 转基因阳性植株的症状表型 | 第49-50页 |
5 瞬间表达及转基因本氏烟中 P6 蛋白的 Western Blot 检测 | 第50-51页 |
讨论 | 第51-54页 |
1 SVBV P6 基因序列的克隆与序列分析 | 第51页 |
2 SVBV 中、美分离物的 P6 基因表达载体及突变体表达载体接种本氏烟 | 第51-53页 |
3 P6 基因转化烟草的症状表型 | 第53-54页 |
结论 | 第54-55页 |
参考文献 | 第55-60页 |
附录A:常用缓冲液及培养基配方法 | 第60-65页 |
附录B:常用的抗生素和激素及使用浓度 | 第65页 |
附录C:常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第65-67页 |
附录D:本文所用的重要缩写词及中文对照 | 第67-68页 |
致谢 | 第68-69页 |
作者简介 | 第69页 |