第一部分 干扰素α-1a通过激活内源线粒体凋亡通路和内质网应激凋亡通路诱导喉癌Hep-2细胞的凋亡 第二部分 微流控蛋白印迹杂交与传统Western蛋白印迹杂交对目的蛋白的检测效果差异比较

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研究背景与目的:喉癌传统的手术切除与放射治疗,可能会造成病人失声、毒性反应等不良后果,针对喉癌的新疗法亟待发掘。干扰素具有抗病毒、抑增殖、调节免疫系统的作用。α干扰素对人类喉癌细胞具有抑增殖的作用。但是,α干扰素调节细胞生长抑制的机理没有被充分的研究。本论文利用喉癌Hep-2细胞为模型,旨在研究IFNα-1a能够抑制喉癌Hep-2细胞增殖的分子机制。材料与方法:选取喉癌Hep-2为细胞模型,通过瞬时转染质粒过量表达IFNα-1a和外加重组蛋白IFNα-1a这两种方式,研究IFNα-1a对Hep-2细胞增殖的影响。利用CCK8和MTT等方法检测IFNα-1a对Hep-2细胞增殖的抑制作用,流式分析检测IFNα-1a是否对Hep-2细胞具有促凋亡作用,用Western Blot方法检测IFNα-1a激活的具体的凋亡信号通路。研究IFNα-1a对组织细胞的特异性时,检测了 IFNα-1a对其他细胞系,如人胚肾上皮细胞HEK-293T、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549,是否具有促凋亡作用。实验结果:IFNα-1a能显著的抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,该抑制过程是通过诱导Hep-2细胞的凋亡来实现。IFNα-1a能抑制抑凋亡蛋白Bcl-XL的表达,促进细胞色素C由线粒体释放到胞浆,并最终激活caspase 3的切割活化,并进一步诱导caspase 3底物PARP-1的切割活化,从而激活了内源线粒体凋亡通路。IFNα-1a也能刺激内质网应激反应(ER-stress)通路相关基因GRP78和CHOP的表达上调,以及caspase4的切割活化,并进一步激活caspase 3的切割活化,也即IFNα-1a激活ER-stress介导的细胞凋亡通路。但外源凋亡通路的标志物蛋白caspase8、caspase10未被切割活化,因此IFNα-1a未激活外源凋亡通路。另外,IFNα-1a对HEK-293T、HepG2、A549未发现有明显的促凋亡影响。实验结论:IFNα-1a通过诱导Hep-2细胞的凋亡抑制了其增殖,IFNα-1a主要是通过内源线粒体凋亡通路和ER-stress凋亡通路来促进Hep-2细胞的凋亡,外源凋亡通路未被激活。IFNα-1a对其他HEK-293T、HepG2、A549细胞的凋亡无显著性影响,也即IFNα-1a对组织细胞的促凋亡作用具有组织特异性的特点。总之,我们的研究揭示了 IFNα-1a抑制喉癌细胞增殖的具体的分子机制。实验背景及说明:传统的Western蛋白印迹杂交在研蛋白质研究领域有相当广泛的应用,是实验室最常用研究技术之一,能对蛋白质进行定性和半定量的分析方法。虽然传统Western蛋白印迹杂交有广泛的应用市场,但其本身还是存在诸如:样品需求量大、费时、费力等的缺点。这里,基于反向蛋白杂交Reverse phase protein array(RPPA)的点杂交原理,我们发明了一种新型微流控纸芯片蛋白印迹杂交,相比传统的Western蛋白印迹杂交,新型微流控纸芯片蛋白印迹杂交具有样品需求量低至1μL,节省试剂至20mL,节省时间至1h,节省劳动力、高通量检测等诸多优点。尤其的,纸芯片蛋白印迹杂交,由于微流控纸芯片本身具有的优点:高比表面积、毛细作用力等,使得纸芯片蛋白印迹杂交可以检测到更微量的蛋白。实验材料与方法:本篇文章以06-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)蛋白为例,选用高表达MGMT蛋白的MCF7细胞为细胞模型,比较传统Western蛋白印迹杂交和纸芯片蛋白印迹杂交分别对经过药物一MGMT阻断剂处理后MCF7细胞的MGMT蛋白表达量的定性以及相对定量结果。实验结果:纸芯片蛋白印迹杂交可以成功进行MGMT的定性、相对定量,而且上样检测蛋白低至10-25pg,这相比于传统Western蛋白印迹杂交的上样检测蛋白1-5ng,提高了 3个数量级。整个操作流程只需要1个小时,所用试剂量少,实验成本更低,而且纸芯片的多通道构造可以实现像反向蛋白杂交分析(RPPA)一样高通量的检测组织蛋白表达量。实验结论:本篇文章的微流控蛋白印迹杂交,能检测到更微量级的蛋白,更节省试剂、样品,省时省力,省钱,高通量检测。微流控纸芯片蛋白印迹杂交的优势被估计可以用于实验室中蛋白的定性以及相对定量。
第一部分第4-49页
    中文摘要第5-7页
    Abstract第7-9页
    中英文缩略语表第9-11页
    前言第11-13页
    实验材料与方法第13-33页
    实验结果第33-42页
    讨论第42-44页
    小结第44-45页
    参考文献第45-49页
第二部分第49-70页
    中文摘要第50-51页
    Abstract第51-53页
    前言第53-55页
    实验材料与方法第55-59页
    实验结果第59-64页
    讨论第64-66页
    实验总结第66-67页
    参考文献第67-70页
致谢第70-72页
个人简历第72-74页
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