晚期糖基化终产物修饰的低密度脂蛋白对肥大细胞活性影响及机制研究

研究背景：糖尿病(Diabetes.DT)是动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）的主要危险因素，其高血糖症导致的晚期糖基化终产物修饰的低密度脂蛋白（Advanced glycation end pruduct modified low density lipoprotein,AGE-LDL）在体内的沉积促进了AS的发生与发展。研究表明，肥大细胞活性与AS的形成和发展及斑块的稳定性相关。尽管未见相关报道，AGE-LDL对肥大细胞活性的影响可能是DT患者易患AS和易发急性心血管事件的重要病因。研究目的：本研究用AGE-LDL刺激小鼠骨髓来源肥大细胞（mouse bonemarrow derived mast cells，mBMMCs），观察其对肥大细胞释放组胺和分泌炎症介质活性的影响，并对相关信号通路进行初步探讨，同时研究了瑞舒伐他汀干预对AGE-LDL作用的影响，为糖尿病致AS和急性心血管事件提供新理论。研究方法：首先分离6-8周龄雄性C57BL/6小鼠骨髓细胞，以重组鼠白细胞介素-3（Recombinant murine Interleukin-3,rmIL-3）和重组鼠干细胞因子（Recombinant murine Stem cell factor，rmSCF）体外诱导骨髓细胞向肥大细胞分化，5周后经甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测进行细胞鉴定。接下来从两个方面研究AGE-LDL对肥大细胞活性的影响：（1）AGE-LDL对肥大细胞释放组胺的影响：给予不同浓度的AGE-LDL刺激，用OPT荧光法检测肥大细胞释放组胺水平；（2）AGE-LDL对肥大细胞释放炎症介质的影响：Real-timePCR检测不同浓度AGE-LDL作用6小时后肥大细胞肿瘤坏死因子α（Tumour necrotic factor-α,TNF-α）、白细胞介素6（Interleukin-6,IL-6）和γ干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）mRNA表达，酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测作用24小时后细胞培养上清中TNF-α、IL-6、IFN-γ的水平。最后对AGE-LDL影响肥大细胞活性可能的信号通路进行研究：(1）用AGE-LDL刺激肥大细胞，分别在0、0.25、0.5、1、2h时用Western印迹法分析核因子κB（Nuclear-κB,NF-κB）、p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化情况。(2）分别给予NF-κB、p38、ERK1/2抑制剂PDTC、SB203580、PD98059和瑞舒伐他汀，再用AGE-LDL刺激肥大细胞，观察细胞释放组胺和分泌炎症介质的情况。(3)Western印迹法检测PDTC、SB203580和PD98059对AGE-LDL促NF-κB磷酸化作用的影响。研究结果：（1）RmIL-3和RmSCF在体外诱导小鼠骨髓细胞培养5周后，甲苯胺蓝染色显示超过95%的细胞被染成蓝紫色，流式细胞仪检测细胞表面分子CD117和FcεRIa表达双阳性率为95.6%，鉴定为成熟的肥大细胞。（2）AGE-LDL对肥大细胞活性的影响：AGE-LDL可刺激肥大细胞释放组胺，在10分钟作用最强，同时该作用呈浓度依赖性，与对照组和非糖化低密度脂蛋白（n-LDL）组相比差异均有统计学意义（p<0.05），在50ug/ml时达峰。不同浓度AGE-LDL刺激可显著上调肥大细胞炎症因子，诸如TNF-α、IL-6、IFN-γmRNA的表达，同时上清中相关因子的水平较对照组明显上调，以50ug/ml作用最强（p<0.05)。（3）AGE-LDL影响肥大细胞活性的信号通路研究：AGE-LDL能够促进p38MAPK、ERK1/2和NF-κB磷酸化，而对JNK磷酸化无影响；AGE-LDL作用15分钟时NF-κB磷酸化、P38MAPK磷酸化均达峰值，作用30分钟时ERK1/2磷酸化达峰值。瑞舒伐他汀能下调AGE-LDL作用下NF-κB、p38MAPK和ERK1/2磷酸化。P38MAPK、ERK1/2抑制剂SB203580、PD98059均能下调AGE-LDL作用下NF-κB的磷酸化。PDTC、瑞舒他汀能够抑制AGE-LDL对肥大细胞释放组胺的影响。NF-κB抑制剂PDTC、ERK1/2抑制剂PD98059和瑞舒伐他汀能抑制AGE-LDL对肥大细胞分泌炎症介质的作用。研究结论：AGE-LDL能够激活肥大细胞，促进其释放组胺和分泌炎症介质TNF-α、IL-6、IFN-γ，该作用与ERK1/2和NF-κB信号通路的激活相关。瑞舒伐他汀能够抑制AGE-LDL对肥大细胞的激活作用。AGE-LDL对肥大细胞活性的影响可能是糖尿病患者易患AS和易发急性心血管事件的重要病因。