| 中文摘要 | 第12-16页 |
| 英文摘要 | 第16页 |
| 符号说明 | 第20-23页 |
| 第一部分 烟草病毒的检测新技术研究——烟草病毒病快速、多元检测技术的建立及应用 | 第23-69页 |
| 1 引言 | 第23-34页 |
| 1.1 指示植物法 | 第23页 |
| 1.2 电镜诊断法 | 第23-25页 |
| 1.2.1 负染色法 | 第24页 |
| 1.2.2 超薄切片法 | 第24页 |
| 1.2.3 免疫电镜技术 | 第24-25页 |
| 1.3 血清学检测方法 | 第25-27页 |
| 1.3.1 酶联免疫吸附法 | 第25-26页 |
| 1.3.2 点免疫结合测定技术 | 第26页 |
| 1.3.3 电化学酶联免疫检测 | 第26-27页 |
| 1.4 核酸分子杂交技术 | 第27-28页 |
| 1.4.1 Southern 杂交 | 第27页 |
| 1.4.2 Northern 杂交 | 第27页 |
| 1.4.3 点杂交 | 第27-28页 |
| 1.5 多聚酶链式反应( PCR)技术 | 第28-31页 |
| 1.5.1 兼并引物PCR 技术 | 第28-29页 |
| 1.5.2 病毒属专化引物 PCR 技术 | 第29页 |
| 1.5.3 RT-PCR | 第29页 |
| 1.5.4 实时逆转录PCR | 第29页 |
| 1.5.5 免疫捕捉PCR 技术 | 第29-30页 |
| 1.5.6 PCR-ELISA 定量分析技术 | 第30页 |
| 1.5.7 PCR 微量板杂交法 | 第30页 |
| 1.5.8 套式PCR | 第30页 |
| 1.5.9 依赖核酸序列的扩增 | 第30-31页 |
| 1.6 双链RNA 技术 | 第31-32页 |
| 1.7 分子灯塔 | 第32页 |
| 1.8 免疫毛细管区带电泳仪 | 第32-33页 |
| 1.9 液相色谱/质谱联用仪和基体辅助激光解吸/电离质谱分析仪 | 第33页 |
| 1.10 石英晶体微平衡免疫传感器 | 第33页 |
| 1.11 本研究的目的和意义 | 第33-34页 |
| 2 材料与方法 | 第34-46页 |
| 2.1 质粒、菌株、酶和试剂 | 第34页 |
| 2.2 方法 | 第34-46页 |
| 2.2.1 病毒的来源 | 第34-35页 |
| 2.2.2 病毒提纯 | 第35-36页 |
| 2.2.2.1 马铃薯 Y 病毒(PVY)的提纯 | 第35页 |
| 2.2.2.2 马铃薯X 病毒(PVX)提纯 | 第35-36页 |
| 2.2.2.3 烟草花叶病毒(TMV)的提纯 | 第36页 |
| 2.2.3 病毒鉴定 | 第36页 |
| 2.2.3.1 病毒粒子的电镜观察 | 第36页 |
| 2.2.3.2 病毒粒体组织超薄切片观察 | 第36页 |
| 2.2.4 RNA 提取 | 第36-37页 |
| 2.2.5 在含有甲醛的凝胶上进行的RNA 电泳 | 第37-38页 |
| 2.2.6 TEV、CMV 和 TRSV 外壳蛋白(CP)基因的克隆 | 第38-43页 |
| 2.2.6.1 引物设计 | 第38-39页 |
| 2.2.6.2 反转录 PCR(RT-PCR)扩增病毒 CP 基因 | 第39-40页 |
| 2.2.6.3 质粒 DNA 的大量提取(碱裂解法) | 第40-41页 |
| 2.2.6.4 质℃温4 质粒 DNA 和扩增的目的片段的酶切 | 第41页 |
| 2.2.6.5 质粒DNA 与目的片段DNA 的连接 | 第41-42页 |
| 2.2.6.6 大肠杆菌BL21 感受态细胞的制备 | 第42页 |
| 2.2.6.7 质粒DNA 向大肠杆菌中转化(热激法) | 第42页 |
| 2.2.6.8 转化菌落PCR 及酶切鉴定鉴定 | 第42-43页 |
| 2.2.7 病毒外壳蛋白基因的原核表达 | 第43页 |
| 2.2.7.1 蛋白诱导表达 | 第43页 |
| 2.2.7.2 SDS-PAGE 分析 | 第43页 |
| 2.2.8 病毒抗体及酶标抗体的制备 | 第43-45页 |
| 2.2.8.1 病毒抗血清的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.8.2 免疫球蛋白(IgG)的纯化 | 第44-45页 |
| 2.2.8.3 碱性磷酸酶标记病毒抗体 | 第45页 |
| 2.2.9 病毒检测技术的优化 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-65页 |
| 3.1 病毒的分离与提纯 | 第46-49页 |
| 3.1.1 马铃薯Y 病毒(PVY-SD-TA)的分离和提纯 | 第46页 |
| 3.1.2 马铃薯X 病毒(PVX-SD1)的分离与提纯 | 第46页 |
| 3.1.3 烟草花叶病毒(TMV)的分离和提纯 | 第46页 |
| 3.1.4 烟草蚀纹病毒(TEV-SD1)分离 | 第46-47页 |
| 3.1.5 黄瓜花叶病毒(CMV-SD1)的分离 | 第47页 |
| 3.1.6 烟草环斑病毒(TRSV-SD1)的的分离 | 第47-49页 |
| 3.2 病毒外壳蛋白基因的克隆、序列分析 | 第49-57页 |
| 3.2.1 PVY-SD-TA 外壳蛋白基因的克隆和序列分析 | 第49页 |
| 3.2.2 PVX-SD1 外壳蛋白基因的克隆与序列分析 | 第49页 |
| 3.2.3 TMV-SD1 CP 基因的克隆和序列分析 | 第49-53页 |
| 3.2.4 TEV-SD1 CP 基因的克隆和序列分析 | 第53-54页 |
| 3.2.5 CMV-SD1 CP 基因的克隆和序列分析 | 第54-56页 |
| 3.2.6 TRSV-SD1 CP 基因的克隆 | 第56-57页 |
| 3.3 病毒CP 基因原核表达 | 第57-58页 |
| 3.3.1 CMV-SD1 CP基因在大肠杆菌中的表达 | 第57页 |
| 3.3.2 TEV-SD1 CP基因在大肠杆菌中的表达 | 第57-58页 |
| 3.3.3 TRSV-SD1 CP基因在大肠杆菌中的表达 | 第58页 |
| 3.4 病毒抗体的制备 | 第58-59页 |
| 3.4.1 病毒抗体免疫球蛋白(IgG)工作浓度的初步确定 | 第58-59页 |
| 3.4.2 酶标IgG 工作浓度的初步确定 | 第59页 |
| 3.4.3 抗体特异性测定 | 第59页 |
| 3.5 DIBA 检测技术的优化及多元病毒检测体系的建立 | 第59-64页 |
| 3.5.1 汁液稀释浓度、处理方式、添加 EDTA 及反应时间对病毒检测影响 | 第60-62页 |
| 3.5.1.1 病毒汁液稀释浓度的确定 | 第60页 |
| 3.5.1.2 PVY、PVX 汁液处理方式对检测效果的影响 | 第60-61页 |
| 3.5.1.3 添加EDTA 对检测效果的影响 | 第61页 |
| 3.5.1.4 抗原与抗体(酶标抗体)反应时间对检测效果的影响 | 第61-62页 |
| 3.5.2 多病毒检测体系中各病毒抗体和酶标抗体工作浓度的确定 | 第62-63页 |
| 3.5.3 多元病毒检测体系的确立 | 第63-64页 |
| 3.6 山东烟区烟草病毒种类及比例调查 | 第64-65页 |
| 4 讨论 | 第65-68页 |
| 4.1 CMV 株系划分 | 第65-66页 |
| 4.2 病毒抗血清制备 | 第66页 |
| 4.3 CP 基因的克隆 | 第66页 |
| 4.4 CP 基因的原核表达 | 第66-67页 |
| 4.5 山东烟区烟草病毒病种群动态变化 | 第67-68页 |
| 5 结论 | 第68-69页 |
| 第二部分 烟草病毒的防治新技术研究—RNA 介导的病毒抗性遗传行为研究及多抗病毒转基因烟草的培育 | 第69-162页 |
| 1 引言 | 第69-91页 |
| 1.1 通过寄主植物的抗病性防治植物病毒病 | 第69-70页 |
| 1.2 通过栽培措施和控制病毒传播介体防治植物病毒病 | 第70-71页 |
| 1.3 依据病毒株系间的交叉保护作用,应用弱毒株系防治植物病毒病 | 第71-73页 |
| 1.4 利用化学药物防治植物病毒病 | 第73-78页 |
| 1.4.1 天然抗病毒剂 | 第73-75页 |
| 1.4.2 合成抗病毒剂 | 第75-78页 |
| 1.5 植物组织脱毒技术在植物病毒病防治中的应用 | 第78-79页 |
| 1.5.1 茎尖分生组织脱毒技术 | 第78页 |
| 1.5.2 热处理脱毒技术 | 第78-79页 |
| 1.5.3 茎尖培养和热处理相结合 | 第79页 |
| 1.6 植物抗病毒基因工程在植物病毒病防治中的应用 | 第79-90页 |
| 1.6.1 非病毒来源基因介导的抗病性 | 第79-81页 |
| 1.6.1.1 利用植物自身的抗病基因 | 第80页 |
| 1.6.1.2 抗体基因工程 | 第80-81页 |
| 1.6.1.3 干扰素 | 第81页 |
| 1.6.2 病毒来源基因介导的抗病性 | 第81-90页 |
| 1.6.2.1 利用病毒衣壳蛋白基因 | 第81-82页 |
| 1.6.2.2 利用病毒复制酶基因 | 第82-83页 |
| 1.6.2.3 利用病毒运动蛋白基因 | 第83-84页 |
| 1.6.2.4 利用病毒的反义RNA | 第84页 |
| 1.6.2.5 利用病毒的卫星RNA | 第84-85页 |
| 1.6.2.6 利用核酶基因 | 第85-86页 |
| 1.6.2.7 利用缺陷干扰型RNA | 第86页 |
| 1.6.2.8 利用RNA 介导的病毒抗性 | 第86-90页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第90-91页 |
| 2 材料与方法 | 第91-99页 |
| 2.1 材料 | 第91-92页 |
| 2.1.1 毒源 | 第91页 |
| 2.1.2 供试材料 | 第91-92页 |
| 2.2 方法 | 第92-99页 |
| 2.2.1 嵌合基因的拼接和hpDNA 构建 | 第92页 |
| 2.2.2 转化菌落PCR 及酶切鉴定鉴定 | 第92页 |
| 2.2.3 序列测定 | 第92页 |
| 2.2.4 植物表达载体的构建 | 第92-94页 |
| 2.2.5 重组植物表达载体向农杆菌中转化(冻融法) | 第94页 |
| 2.2.6 农杆菌介导的外源基因向烟草中转化及转化植株的获 | 第94-95页 |
| 2.2.7 转基因植株的卡那霉素(Km)抗性鉴定 | 第95页 |
| 2.2.8 转基因植株的抗病性鉴定 | 第95页 |
| 2.2.9 间接ELISA 检测 | 第95页 |
| 2.2.10 烟草的DNA 提取(CTAB 法) | 第95-96页 |
| 2.2.11 转基因植株的PCR 检测 | 第96页 |
| 2.2.12 转基因植物的Southern blot 分析 | 第96-98页 |
| 2.2.12.1 植物总DNA 的酶切 | 第96页 |
| 2.2.12.2 DNA 凝胶电泳 | 第96页 |
| 2.2.12.3 转膜 | 第96-97页 |
| 2.2.12.4 探针的制备 | 第97页 |
| 2.2.12.5 杂交 | 第97-98页 |
| 2.2.13 植物总RNA 的提取及Northern 杂交 | 第98-99页 |
| 2.2.13.1 植物总RNA 提取和电泳 | 第98页 |
| 2.2.13.2 转膜 | 第98页 |
| 2.2.13.3 探针制备 | 第98页 |
| 2.2.13.4 杂交 | 第98-99页 |
| 3 结果与分析 | 第99-116页 |
| 3.1 RNA 介导的病毒抗性在转基因烟草中的遗传分析 | 第99-106页 |
| 3.1.1 T1 代转基因植株的遗传和抗病性分析 | 第99-101页 |
| 3.1.2 T2 代转基因植株的遗传和抗病性分析 | 第101-102页 |
| 3.1.3 T3 和T4 代转基因植株的抗病性和mRNA 积累量分析 | 第102-103页 |
| 3.1.4 转基因植株中外源基因的整合方式与 RNA 介导的病毒抗性的关系 | 第103-106页 |
| 3.2 hpRNA 对RNA 介导的病毒抗性产生的影响 | 第106页 |
| 3.3 抗PVY、TMV 和CMV 多抗转基因烟草的培育 | 第106-116页 |
| 3.3.1 Hairpin 结构嵌合基因的构建 | 第106-109页 |
| 3.2.2 植物表达载体的构建 | 第109-110页 |
| 3.3.3 转基因植株的获得 | 第110-111页 |
| 3.3.4 转化植株的PCR 检测 | 第111页 |
| 3.3.5 转基因植株抗病性分析 | 第111-114页 |
| 3.3.6 转基因植株的Southern blot 分析 | 第114-115页 |
| 3.3.7 转基因植株Northern blot 分析 | 第115-116页 |
| 4 讨论 | 第116-118页 |
| 4.1 RNA 介导的病毒抗性的遗传行为 | 第116页 |
| 4.2 转基因拷贝数和转基因结构与RNA 介导的病毒抗性的产生 | 第116-117页 |
| 4.3 多病毒转基因植物的研究 | 第117-118页 |
| 5 结论 | 第118-120页 |
| 5.1 RNA 介导的病毒抗性在转基因烟草中遗传分析 | 第118-119页 |
| 5.2 发夹结构RNA(hpRNA)对RNA 介导的病毒抗性产生的影响 | 第119页 |
| 5.3 多抗病毒转基因烟草的培育 | 第119-120页 |
| 6 参考文献 | 第120-138页 |
| 7 附录 | 第138-161页 |
| 7.1 质粒图谱 | 第138-140页 |
| 7.2 常用培养基母液及细菌培养基的配制 | 第140-144页 |
| 7.3 常用抗生素、激素及生化试剂的配制 | 第144-146页 |
| 7.4 常用缓冲液的配制 | 第146-147页 |
| 7.5 克隆的基因序列 | 第147-161页 |
| 7.5.1 PVY-SD-TA CP | 第147-149页 |
| 7.5.2 PVX-SD1 CP | 第149-151页 |
| 7.5.3 TMV-SD1 CP | 第151-153页 |
| 7.5.4 TEV-SD1 CP | 第153-155页 |
| 7.5.5 CMV-SD1 CP | 第155-157页 |
| 7.5.6 TRSV-SD1 CP | 第157-160页 |
| 7.5.7 构建的hpRNA 结构的嵌合基因 | 第160-161页 |
| 8 致谢 | 第161-162页 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 | 第162页 |
