野油菜黄单胞菌野油菜致病型胞外多糖产生有关的一基因簇的鉴定和分析

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本室原已从Xcc野生型菌株8004克隆到含有EPS产生相关基因的9.4kbHindⅢ DNA片段,本研究进一步构建了这一片段的6种限制性内切酶酶切图谱,通过转座子Tn5gusA5插入诱变这一克隆片段和标记置换(marker exchange)构建突变体,发现其中连续的7kb区域中含有一个与EPS产生有关的基因簇,由于未能获得转座子插入及实质,还不清楚于另一端的余下的2kb区域是否与EPS产生有关。将含有这9.4kb DNA片段的重组质粒导入菌株8004,能提高EPS的产量2.8倍。 本研究对以上9.4kbDNA中的“1.9”kb EcoR1 片段进行了测序分析,测序分析结果表明这一片段实际长度为1880bp。进一步对这1880bp DNA进行分析,其中含有一个完整的开放阅读框架(ORF2)和一个不完整的开往阅滨框架(ORF1),ORF1和ORF2的推断性编码产物分别与已报道的GumA和GumB蛋白在氨基酸水平上具有100%的同源性。GumA是一种作用范围较广的调控蛋白,被称为整合寄主因子(IHFα),在大肠杆菌中是由himA基因编码的。GmB可能与糖核苷聚合或EPs输出有关。 本工作还利用所构建的EPS-突变体探讨了EPS对Xcc致病性的影响,结果表明,EPS的产量与致病性呈正相关,按种浓度的大小直接影响到致能力。通过电镜观察还发现,EPS对Xcc从气孔入侵寄主能力具有重要作用。
摘要第6-8页
第一章 前言第8-42页
    第一节 植物病原细菌分子遗传学发展简史及基因类群第8-9页
        一 发展简史第8-9页
        二 已发现的植物病原细菌的基因类群第9页
    第二节 黄单胞菌(Xanthomonas)的生物学及相关的分子遗传学操作技术简介第9-15页
        一 黄单胞菌概述第9-11页
        二 已应用于黄单胞菌的主要遗传操作技术及其评价第11-15页
            (一) “致病基因”(pathogenicity gene)第11页
            (二) 诱变技术(mutagenesis)第11页
            (三) 基因转移和交换(gene transportation and exchange)第11-13页
            (四) 致病性相关基因的鉴定方法第13-14页
            (五) 相关基因的致病性评价方法--致病性检测第14-15页
    第三节 黄单胞菌及其它植物病细菌致病性相关基因第15-22页
        一 无毒基因(avirulence gene;avr)第15-16页
        二 胞外酶基因(extracellular enzyme)第16-17页
        三 酶分泌的相关基因第17页
        四 致病因子调控相关基因第17-19页
        五 脂多糖(LPS)基因第19-21页
        六 胞外多糖(EPS)基因第21页
        七 黄单胞菌的伞毛(fimbriae)第21-22页
        八 功能不明的致病性基因及色素基因第22页
    第四节 黄单胞菌及其它植物病原细菌分子遗传学研究现状及部分最新研究进展第22-39页
        一 植物病原细菌无毒基因(avr)研究进展第22-26页
        二 植物病原细菌过敏性反应基因(hrp)研究现状和展望第26-31页
        三 病原细菌胞外多糖(EPS)的分子遗传学研究现状第31-34页
        四 细菌信号传递-TCS系统第34-36页
        五 植物病原细菌-植物相互作用中的活性氧:AOS第36-37页
        六 枯斑反应中的脂肽植物毒素(lipopeptide phytotoxins)第37-39页
    第五节 野油菜黄单胞菌野油菜致病型(Xanthomonas campestris pu.campestris;Xcc)及本论文研究目的第39-42页
        一 研究Xcc的意义第39页
        二 研究Xcc的必要第39页
        三 Xcc EPS的分子遗传学研究进展第39-41页
        四 本论文研究目的第41-42页
第二章 本研究的供试材料与常规方法第42-58页
    2.1 供试菌株与质粒第42-45页
    2.2 培养基及培养条件第45-46页
    2.3 抗菌素第46-47页
    2.4 溶液、缓冲液和试剂第47页
    2.5 DNA的纯化第47-48页
    2.6 DNA的沉淀及保存第48页
    2.7 DNA的提取第48-50页
    2.8 质粒DNA的转化第50-51页
    2.9 琼脂糖凝胶电泳第51页
    2.10 DNA回收第51-52页
    2.11 DNA连接第52-53页
    2.12 DNA-DNA杂交第53-55页
    2.13 三亲本接合(triparants conjugation)第55-56页
    2.14 β-葡糖苷酸酶活性的定性检测(β-glucuronidase,GUS)第56页
    2.15 胞外多糖(EPS)的检测第56-57页
    2.16 胞外酶的平板定性检测第57页
    2.17 培养条件下Xcc生长曲线的测定第57-58页
第三章 Xcc 9.4kb Hind Ⅲ DNA片段的酶切图谱第58-65页
    3.1 方法第58页
    3.2 结果与分析第58-63页
    3.3 小结与讨论第63-65页
第四章 利用转座子Tn5 gus A5插入诱变Xcc的9.4kb Hind Ⅲ DNA片段第65-78页
    4.1 方法第65-67页
    4.2 结果与分析第67-77页
    4.3 小结与讨论第77-78页
第五章 1.9kb EcoR1 DNA片段的测序分析第78-88页
    5.1 本研究所用的测序策略第78-79页
    5.2 方法第79-82页
    5.3 结果与分析第82-86页
    5.4 小结与讨论第86-88页
第六章 9.4kb Hind Ⅲ DNA片段对EPS的增产作用第88-91页
    6.1 方法第88页
    6.2 结果与分析第88-90页
    6.3 小结与讨论第90-91页
第七章 胞外多糖突变体的致病性第91-99页
    7.1 方法第91-92页
    7.2 结果与分析第92-97页
    7.3 小结与讨论第97-99页
第八章 本研究工作的主要发现、意义及进一步工作的部分设想第99-100页
参考文献第100-115页
结语第115-116页
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