TCF7L2基因多态性及RNA干扰对胰岛素原水平的影响及机制

目的:探讨重庆地区汉族人群中TCF7L2（Transcription factor7-like2）、PCSK1（Proprotein convertase subtilisin/kexin type1）和PCSK2（Proprotein convertase subtilisin/kexin type2）的单核苷酸多态性（Singlenucleotide polymorphisms, SNPs）和新诊2型糖尿病（Type2diabetesmellitus, T2DM）及血清胰岛素原水平的相关性。方法：采用病例-对照研究方法，研究对象包括对照组（n=152例），新诊T2DM组（n=227例）。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951和PCSK2的rs2021785位点进行SNPs分型。采用酶联免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）测定空腹血清胰岛素原水平。统计学分析采用SAS8.1软件，遗传学分析采用在线软件完成。结果：Hardy-Weinberg平衡检验P>0.05，拟合度优良。连锁不平衡分析发现TCF7L2的rs7903146和rs11196218位点不存在连锁不平衡现象，不能构建单倍型（D’=0.348, r2=0.018）。T2DM组PCSK2的rs2021785位点次要等位基因频率（Minor allele frequency, MAF）显著低于对照组（20.04%vs26.64%, p=0.0335）,在共显性模型中，该位点的基因型分布与T2DM显著相关[Odds ratio（OR）=0.627,95%CI（0.409,0.962），p=0.0308]。TCF7L2的rs7903146位点的基因型分布和I30/G30显著相关（OR=1.012，95%CI1.0001.025，P<0.05），在校正了性别、年龄和BMI后，TT和CT基因型携带者的I30/G30显著高于CC基因型携带者（P=0.0385）。T2DM组和对照组比较，TCF7L2的rs7903146和rs11196218和PCSK1的rs3811951位点的MAF和基因型分布差异均无统计学意义（P>0.05）。以上SNPs位点不同基因型携带者空腹血清胰岛素原的水平均无统计学差异（P>0.05）,不同基因型携带者间胰岛素原/胰岛素比值的差异亦无统计学意义（P>0.05）。结论：本研究在重庆地区的汉族人群中证实了PCSK2的rs2021785位点SNPs和T2DM显著相关，TCF7L2的rs7903146可能与早相胰岛素分泌有关，但尚未发现TCF7L2的rs7903146和rs11196218、PCSK1的rs3811951位点SNPs和T2DM的相关性，亦未发现以上SNPs位点与空腹胰岛素原及胰岛素原/胰岛素比值的相关性。目的:首先证实TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点；其次探讨TCF7L2干扰对胰岛素原的影响及机制。方法：通过体外培养Beta-TC-6细胞株，首先采用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术证实TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点；其次通过构建TCF7L2的慢病毒干扰载体，下调TCF7L2的表达，采用荧光定量PCR和Western Blotting方法检测TCF7L2和前蛋白转化酶基因mRNA及蛋白水平的变化，收集细胞培养液，采用ELISA方法测定基础和葡萄糖刺激状态下胰岛素和胰岛素原水平的变化；最后采用流式细胞仪检测TCF7L2干扰对胰岛β细胞凋亡的影响。结果：1. ChIP实验证实：Beta-TC-6细胞中TCF4抗体免疫沉淀的ChIP产物中能扩增到PCSK1和PCSK2基因的启动子。2. TCF7L2慢病毒干扰载体的构建及干扰效率的鉴定：酶切和测序均证实重组干扰质粒核苷酸序列插入正确，流式细胞仪测定病毒平均滴度1.2×109IU/ml。慢病毒感染Beta-TC-6细胞48小时后，在荧光显微镜下观察慢病毒感染效率达80%以上，TCF7L2干扰组TCF7L2无论是mRNA还是蛋白表达水平均显著低于对照组（P<0.05，n=3）。mRNA的干扰效率约为75%，蛋白水平的干扰率约为50%。3. TCF7L2干扰对前蛋白转化酶表达和活性的影响：①TCF7L2表达下调后，PCSK1和PCSK2基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P <0.05，n=3）；②TCF7L2表达下调后，葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著降低，而葡萄糖刺激后胰岛素原分泌及胰岛素原/胰岛素比值显著增加（P <0.05，n=3），提示前蛋白转化酶活性降低；③TCF7L2表达下调后，胰岛β细胞的凋亡率显著增加（P <0.05，n=5）。结论：TCF7L2表达的转录因子在前蛋白转化酶基因的启动子上存在结合位点。TCF7L2表达下调可能通过降低前蛋白转化酶基因的表达及酶的活性，进而影响胰岛素原的加工和胰岛β的功能。