五种野生稻中包含Pi2/9遗传座位的BAC克隆的筛选与序列初步分析

Pi2/9遗传座位论文鸟枪法测序论文同源搜索论文

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在水稻Ⅵ号染色体着丝粒区域的Pi2／9遗传座位中至少包含五个稻瘟病抗性基因：Pi2，Pi9，Piz-t，Piz，Pigm。它们都来自不同供体。其中已克隆到的三个基因：Pi2，Pi9，Piz-t编码序列高度同源的NBS-LRR蛋白，对稻瘟病菌都显示出了极强的广谱抗性。为初步分析该遗传座位在AA基因型野生稻(Oryza nivara、Oryza rufipogon)中的分布情况，本文使用同源搜索的方法从上述野生稻BES数据库中获得了三个候选克隆，应用杂交方法对它们进行了鉴定。发现它们的序列高度同源，其中OR_BBa0100819的长度最长。初步分析已经获得的BBCC基因型野生稻(Oryza minuta)中可能包含Pi2／9遗传座位的BAC克隆OM_Ba0030A22和OM_Ba0045A15的序列后，发现OM_Ba0030A22只含有Pi2／9遗传座位的同源序列，并未覆盖该遗传座位，OM_Ba0045A15部分覆盖了该遗传座位。使用同源搜索的方法获得了OM_Ba0045A15可能的延伸克隆OM_Ba0024C01，进一步的杂交鉴定发现二者并不具有重叠区域。使用鸟枪法测定了OR_BBa0100819和OM_Ba0024C01的序列，分析发现OM_Ba0024C01也覆盖了部分Pi2／9遗传座位。使用同源搜索的方法获得了它的延伸克隆OM_Ba0103F07，进一步分析后发现这两个BAC克隆仍未完全覆盖Oryza minuta中的Pi2／9遗传座位。本文还初步分析了已经完全测序的不同野生稻中包含Pi2／9遗传座位的BAC克隆的序列，发现其中包含的NBS-LRR基因都属于同一进化枝。BBCC基因型野生稻中的Pi2／9遗传座位很可能来源于BB基因型野生稻。

中文摘要	第8-9页
英文摘要	第9页
1 前言	第10-18页
1.1 植物抗病基因简介	第10-15页
1.1.1 NBS-LRR	第13-14页
1.1.2 LRR-TM	第14页
1.1.3 STK	第14页
1.1.4 LRR-TM-STK	第14-15页
1.1.5 其他	第15页
1.2 植物抗病基因的进化	第15-16页
1.3 水稻抗病基因的研究进展	第16页
1.4 Pi2/9遗传座位	第16-18页
2 材料与方法	第18-28页
2.1 材料	第18-20页
2.1.1 所用BAC克隆	第18页
2.1.2 载体	第18页
2.1.3 菌种	第18-19页
2.1.4 主要试剂、酶类和试剂盒	第19页
2.1.5 主要仪器	第19-20页
2.2 方法	第20-28页
2.2.1 BAC DNA的小量制备	第20页
2.2.2 制备好的BAC DNA的酶切	第20-21页
2.2.3 杂交	第21-23页
2.2.3.1 转膜	第21页
2.2.3.2 探针标记	第21页
2.2.3.3 预杂交	第21-22页
2.2.3.4 杂交	第22页
2.2.3.4 洗膜	第22页
2.2.3.5 信号检测	第22-23页
2.2.4 BAC DNA的大量抽提	第23页
2.2.5 BAC测序亚库的构建	第23-24页
2.2.5.1 超声打断	第23页
2.2.5.2 插入片段的回收与连接	第23-24页
2.2.5.3 连接产物的回收与转化	第24页
2.2.6 亚克隆文库的保存	第24页
2.2.7 亚克隆DNA的抽提	第24-25页
2.2.8 测序反应	第25-26页
2.2.8.1 测序PCR	第25-26页
2.2.8.2 测序产物的回收及上样	第26页
2.2.9 序列组装	第26页
2.2.10 序列空缺的填补	第26页
2.2.11 序列分析	第26-27页
2.2.12 进化树绘制	第27-28页
3 结果与分析	第28-48页
3.1 Oryza nivara、Oryza rufipogon、Oryza minuta中覆盖Pi2/9遗传座位的BAC克隆的筛选	第28-33页
3.1.1 BAC末端序列的同源搜索	第28-29页
3.1.2 候选BAC克隆的鉴定	第29-33页
3.1.2.1 BAC克隆的完全酶切	第29-30页
3.1.2.2 Southern杂交确定代测BAC克隆中NBS-LRR基因的分布情况	第30-31页
3.1.2.3 供试BAC克隆的指纹分析	第31-33页
3.2 OR_BBA0100B19和OM_BA0024C01两个BAC克隆测序亚克隆文库的构建与序列测定	第33-40页
3.2.1 高纯度BAC DNA的抽提	第33-34页
3.2.2 BAC DNA的超声打断和末端补平	第34页
3.2.3 所需片段的回收及连接	第34-35页
3.2.4 所需亚克隆文库大小的估计	第35-37页
3.2.5 亚克隆文库测序样品的制备	第37-38页
3.2.6 序列测定	第38页
3.2.7 序列组装	第38-40页
3.3 Oryza minuta中Pi2/9遗传座位的延伸	第40-43页
3.3.1 延伸克隆的同源搜索	第40-41页
3.3.2 BAC克隆OM_Ba0178G06和OM_Ba0103F07的鉴定	第41-43页
3.3.2.1 Southern杂交确定OM_Ba0178G06和OM_Ba0103F07中NBS-LRR基因的分布情况	第41页
3.3.2.2 OM_Ba0103F07和OM_Ba0024C01的指纹分析	第41页
3.3.2.3 杂交确定OM_Ba0103F07中是否含有NIP基因	第41-43页
3.4 Oryza punctata中覆盖Pi2/9遗传座位的BAC克隆测序缺口的补平	第43-45页
3.5 Oryza punctata、Oryza officinalis、Oryza minuta中Pi2/9遗传座位的初步分析	第45-48页
3.5.1 遗传座位中包含的NBS-LRR基因的预测	第45-46页
3.5.2 预测出的NBS-LRR基因及基因类似物的进化分析	第46-48页
4 讨论	第48-50页
4.1 水稻BES和EST数据库的应用	第48页
4.2 Shot-gun法测定BAC克隆的序列	第48-49页
4.3 序列的初步分析	第49-50页
5 参考文献	第50-53页
6 附录	第53-56页
7 致谢	第56页

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论文编号ABS1996591，这篇论文共56页

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