昆明市烟草病毒鉴定及花叶病的绿色防控技术研究

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烟草病毒病是烟叶生产中重要限制因素,引起产量降低质量下降,目前没有有效的防控措施。本文首先调查采样,通过ELISA检测分析,初步了解了云南昆明市各烟区烟草上烟草病毒种类及发生分布情况,研究了主要病毒病害烟草花叶病毒病的绿色防控技术。为了解掌握昆明烟区烟草病毒种类和发生分布情况,本论文自2010和2011年两个烟草生产季对昆明各烟叶种植县(市、区)进行田间调查采样。田间调查发现由烟草花叶病毒(TMV)引起的花叶病是主要病害,严重地块的发病率达90%。共采集疑似病毒病样318份,用ELISA检测技术对样品进行检测,共检测到病毒13种,即TMV、马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草坏死病毒(TNV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)、南美红辣椒脉斑驳病毒(ChiVMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、番茄环纹斑点病毒(TZSV)、鸢尾黄斑病毒(IYSV)、花生黄斑病毒(GYSV)、花生顶芽坏死病毒(GBNV)和凤仙花坏死斑病毒(INSV).除TMV外,其余病毒检出率分别为:PVY为11.95%、CMV为0.86%、TEV为10.40%、TNV为15.85%、TVBMV为38.12%、ChiVMV为10.40%、TSWV为11.32%、TZSV为44.83%、IYSV为1.72%、GYSV为0.86%、GBNV为6.03%和INSV为1.72%。进一步用RT-PCR对ELISA检测为TVBMV、ChiVMV、TSWV、TZSV和INSV阳性的部分样品进行检测。序列测定、分析发现:TVBMV的寻甸分离物和宜良分离物3’-末端序列(1624nt)与NCBI上报道的TVBMV云南分离物(AM236826)的核苷酸序列相似性最高,相似性分别为97%和92.7%;CP氨基酸相似性分别为98.5%和95.9%。ChiVMV宜良分离物3’-末端序列(1792nt)与NCBI上报道的ChiVMV印度辣椒分离物(EF213675)的核苷酸序列相似性最高,相似性为84%;CP氨基酸相似性为88.7%。得到4个县的TZSV病毒分离物共21个,经扩增测序和序列比对鉴定为同一分离物,与GenBank中报道的TZSV N基因序列(NC010489)核苷酸相似性在93.5%~99.6%之间;氨基酸相似性在98.2%~99.3%之间。得到4个县的7个TSWV N基因序列,序列比对鉴定为同一分离物,与GenBank中报道的TSWVN基因序列(NC002051)核苷酸相似性在95.4%~95.8%之间;氨基酸相似性在97%~97.5%从石林的2个样品中分离得到了INSV病毒分离物,序列比对鉴定为同一分离物,该分离物与本实验室报道的INSV蝴蝶兰分离物N基因的核苷酸相似性为98.4%(HQ317133);氨基酸相似性为99.6%。在3’-末端测序的基础上,首次对云南烟草上分离到的ChiVMV全序列进行了测定,得到9724nt的序列,NCBI Blastn同源性比对结果显示,所得ChiVMV全序列与NCBI上报道的文昌(海南)ChiVMV辣椒分离物全序列(GQ981316)同源性最高,为93%。据NCBI报道的ChiVMV全序列,本论文所述的ChiVMV全序列为烟草分离物ChiVMV全序列的首次报道。通过田间试验,筛选到三种生物源有机诱导抗病剂:3-丙酮基-3-羟基羟吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole, AHO)、多肽保(Devitalized Mycelium of Penicillium, DMP)和几丁聚糖(Chitosan)能够有效抑制TMV。AHO和几丁聚糖在移栽后每7天分别喷施1次,连续用药4次后,AHO对TMV的相对防效为63.22%,几丁聚糖的相对防效仅为20.04%;多肽保作为移栽时底肥施用,在移栽4周后的相对防效为87.43%。在组合试验中,以多肽保为育苗基质和移栽时底肥,在每次剪苗前分别喷施AHO和几丁聚糖,移栽后每7天喷施1次,连续用药4次后,结果分析发现:“AHO+多肽保”和“多肽保+几丁聚糖”两个组合试剂的相对防效显著优于各种药剂单独施用的效果。“AHO+多肽保”移栽7周后的平均相对防效为78.41%,“多肽保+几丁聚糖”移栽7周后的平均相对防效为69.71%。“AHO+多肽保”组合防控试剂不仅能够满足烟草生产对TMV防控的需求,而且施用生物源抗病毒制剂AHO和多肽保能够大大减少化学农药的施用,既降低了烟叶的化学农药残留,又有效保护了生态环境。
摘要第4-6页
Abstract第6-7页
第一章 文献综述第10-21页
    1.1 前言第10-12页
    1.2 植物病毒检测主要技术与方法第12-18页
        1.2.1 指示植物检测法第13页
        1.2.2 清学检测法第13-15页
        1.2.3 电子显微镜检测法第15-16页
        1.2.4 分子生物学检测方法第16-17页
        1.2.5 各种检测方法优缺点第17-18页
    1.3 植物病毒防治防控方法第18-19页
        1.3.1 农业防治第18-19页
        1.3.2 物理防治第19页
        1.3.3 化学防治第19页
        1.3.4 生物防治第19页
    1.4 本研究的目的和意义第19-21页
第二章 烟草主要病毒病病原的检测鉴定第21-36页
    2.1 实验材料第21-22页
        2.1.1 样品采集第21页
        2.1.2 实验主要试剂及材料第21页
        2.1.3 实验主要仪器第21页
        2.1.4 引物第21-22页
    2.2 实验方法第22-26页
        2.2.1 TAS-ELISA检测步骤第22页
        2.2.2 DAS-ELISA检测步骤第22页
        2.2.3 电镜负染色观察第22-23页
        2.2.4 汁液摩擦法接种植物病毒第23页
        2.2.5 植物总RNA提取(LiCl沉淀法)第23页
        2.2.6 两步RT-PCR法扩增目的基因第23-24页
        2.2.7 PCR产物纯化及回收第24页
        2.2.8 目的片段与质粒载体连接第24页
        2.2.9 转化第24-25页
        2.2.10 扩大培养第25页
        2.2.11 Cracking对重组质粒的快速鉴定第25页
        2.2.12 菌落PCR筛选阳性克隆第25页
        2.2.13 碱裂解法提取质粒第25-26页
        2.2.14 序列测定及分析第26页
    2.3 结果与分析第26-35页
        2.3.1 烟草病毒ELISA检测结果第26-30页
        2.3.2 电镜观察结果第30页
        2.3.3 几种病毒的分子检测第30-35页
    2.4 讨论第35-36页
第三章 天然源烟草花叶病毒抑制剂药效研究第36-63页
    3.1 植物源新型病毒抑制剂接毒药效试验第36-41页
        3.1.1 试验材料第36-37页
        3.1.2 试验方法第37-38页
        3.1.3 结果与分析第38-40页
        3.1.4 讨论第40-41页
        3.1.5 小结第41页
    3.2 天然源抗TMV抑制剂药效试验第41-50页
        3.2.1 试验材料第41页
        3.2.2 苗期试验方法第41-42页
        3.2.3 大田试验方法第42-44页
        3.2.4 试验期间管理措施第44页
        3.2.5 病情调查方法第44页
        3.2.6 苗期试验结果第44-45页
        3.2.7 大田期药效试验结果第45-49页
        3.2.8 讨论第49-50页
    3.3 烟草TMV防控药剂优化组合研究第50-61页
        3.3.1 试验材料第50页
        3.3.2 苗期试验方法第50-51页
        3.3.3 大田试验方法第51-53页
        3.3.4 田间管理措施第53页
        3.3.5 病情调查方法第53页
        3.3.6 结果与分析第53-60页
        3.3.7 讨论第60-61页
    3.4 组合试剂“AHO+多肽保”试验示范第61-63页
小结第63-64页
参考文献第64-67页
附表1 病毒中英文名称缩略表及Genbank登录号第67-69页
附录Ⅰ 常用缓冲液和培养基配方第69-71页
附录Ⅱ 在读期间研究成果第71-73页
致谢第73页
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