肥胖在全球范围内流行,近几十年来尤其是发展中国家在经济快速增长、生活方式西化的同时,肥胖发病率迅速升高,成为新的肥胖重灾区。肥胖同时成为2型糖尿病、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病的重要危险因素。脂肪组织并非单纯能量贮存之器官,脂肪组织做为胰岛素敏感性组织,在胰岛素抵抗中占有重要地位,它重要的内分泌功能在于其通过分泌多种细胞因子调节全身胰岛素敏感性。SOCS-3(suppressor of cytokine signaling-3)是SOCS家族的重要成员之一,近年的许多研究发现SOCS-3在瘦素抵抗、胰岛素信号传导及胰岛素抵抗中亦占有重要作用。已知氧化应激增强是胰岛素抵抗发生机制之一,氧化应激反应如何导致脂肪组织产生胰岛素抵抗,机制尚未完全阐明,是否与氧化应激改变了脂肪细胞中SOCS-3的表达有关,相关的实验研究并不多见。以吡格列酮为代表的噻唑烷二酮类药物(TZDs)是过氧化物酶体增殖体激活受体-Y(PPAR-γ)激动剂,广泛使用于胰岛素增敏及抗糖尿病治疗,它通过调节靶基因表达发挥多种作用改善胰岛素敏感性,吡格列酮干预对氧化应激情况下SOCS-3的表达是否存在影响亦不清楚。本课题以成熟的3T3-L1脂肪细胞为研究对象,给予不同形式的H202刺激,使细胞内ROS(Reactive Oxygen Species)水平增高、模拟氧化应激反应增强的状态,流式细胞技术检测3T3-L1脂肪细胞内ROS的变化,继而利用real-time PCR及Western-blot等方法观察脂肪细胞中SOCS-3表达的变化并初步探讨其可能的机制。本实验同时观察抗氧化剂α-硫辛酸、PPAR-γ激动剂吡格列酮的干预对3T3-L1脂肪细胞在氧化应激增强情况下SOCS-3表达的影响,以期加深对脂肪组织胰岛素抵抗发生机制的理解,并提出对胰岛素抵抗预防、治疗方向的新探讨。一材料和方法:1.细胞诱导通过IBMX+地塞米松+胰岛素的三联诱导剂方案诱导3T3-L1前脂肪细胞转变为成熟脂肪细胞,通过油红染色及定量Real-time PCR检测脂联素mRNA表达水平两种方法,鉴定成熟脂肪细胞。2.氧化应激及抗氧化剂干预①Ctrl组:成熟3T3-L1脂肪细胞②H组:直接对3T3-L1脂肪细胞给予较高浓度H2O2(0.5mmol/L)短暂刺激15分钟,模拟急性的氧化应激增强。H1组H2O2(0.5mmol/L)5分钟H2组H2O2(0.5mmol/L)10分钟③GO组:葡萄糖氧化酶(100m IU/L)与高糖培养基缓慢作用4小时产生持续较低浓度的H202,模拟较为温和持久增强的氧化应激反应。④GO+LA组:葡萄糖氧化酶(100mIU/L)处理4小时,同时α-硫辛酸(2.5mmol/L)做为抗氧化剂干预。通过流式细胞仪检测确定细胞内ROS水平的增高,利用real-time PCR及Western-blot方法检测3T3-L1脂肪细胞中SOCS-3mRNA及蛋白表达水平的变化,real-time PCR检测脂联素、抵抗素,肿瘤坏死因子等脂肪因子的mRNA水平变化。ELISA去测定脂联素的蛋白水平。3.氧化应激及吡格列酮干预①Ctrl组:成熟3T3-L1脂肪细胞②GO组:葡萄糖氧化酶(100m IU/L)处理4小时(DGO+PGZ组:PPAR-y激动剂吡格列酮(10μmol/L)12小时预处理后,葡萄糖氧化酶(100m IU/L)处理4小时。观察在持续增高的过氧化氢刺激状态下,吡格列酮对细胞内ROS水平变化及SOCS-3mRNA及蛋白表达水平、脂联素mRNA的影响。实验检测方法同2。二主要结果:1①成熟的3T3-L1脂肪细胞中可见多量红色脂滴聚集,在诱导分化8至10天时通过油红染色清晰可见。检测脂肪细胞的marker基因-脂联素mRNA,在诱导分化过程中逐渐增高。由此判断3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞。②流式细胞仪检测H,H1,H2组及GO组的3T3-L1脂肪细胞内ROS荧光强度均明显增强(P<0.05),GO+LA组中的ROS荧光强度低于GO组(P<0.05)。③H1,H2组脂肪细胞中SOCS-3m RNA及蛋白表达与对照组相比有上升趋势,H2组中的变化达到统计学差异。(P<0.05);H组及GO组3T3-L1脂肪细胞中SOCS-3m RNA及蛋白表达均明显增高(P<0.05),其中GO组变化更为明显,Real-time PCR结果显示SOCS-3m RNA较对照组增高4-6倍(P<0.05)。GO+LA干预组与GO组相比,3T3-L1脂肪细胞SOCS-3表达水平下降(P<0.05)。④H组及GO组3T3-L1脂肪细胞中,抵抗素、肿瘤坏死因子-α mRNA水平上升(P<0.05),脂联素mRNA水平及培养基中脂联素蛋白浓度均下降(P<0.05)。GO+LA组脂联素m RNA及培养基中浓度较GO组上升(P<0.05),抵抗素和肿瘤坏死因子-α mRNA水平下降(P<0.05)。2①GO及GO+PGZ组的3T3-L1脂肪细胞经100mIU/L葡萄糖氧化酶处理4小时后,细胞内ROS水平较对照组增高(P<0.05),GO+PGZ组与GO组相比,脂肪细胞内的ROS水平相比略低,但差异无统计意义(P>0.05)。②GO及GO+PGZ组的3T3-L1脂肪细胞经葡萄糖氧化酶处理后,SOCS-3mRNA及蛋白表达水平较对照组增高(P<0.05),GO+PGZ组SOCS-3增高程度低于GO组(P<0.05)。③GO+PGZ组的3T3-L1脂肪细胞经葡萄糖氧化酶处理后,细胞内脂联素mRNA水平高于GO组(P<0.05),与对照组相比,差异无统计学意义。三结论1.细胞内ROS水平的增高可诱导3T3-L1成熟脂肪细胞中SOCS-3的表达增高,与此同时伴随着脂联素、抵抗素,TNF-α等脂肪因子表达的改变,推测这些变化共同构成氧化应激致脂肪组织胰岛素抵抗的分子机制的一部分,抗氧化剂α-硫辛酸可以明显减轻ROS的作用,提示抗氧化治疗可能通过部分抑制SOCS-3上调,发挥治疗或预防胰岛素抵抗的作用。2. PPAR γ激动剂吡格列酮可部分抑制3T3-L1脂肪细胞在氧化应激情况下SOCS-3的表达上调,这一作用并不依赖于降低氧化应激时细胞内增高的ROS水平,推测吡格列酮可能通过促进脂联素合成,或通过PPAR γ激动以外的某种机制降低SOCS-3表达,从而发挥改善胰岛素敏感性及更为广泛的作用。