目的：目前,关于糖尿病血管病变的机制尚未完全阐明,存在有多种假说,其中内皮祖细胞(EPC)功能失调使糖尿病血管新生受损的机制研究已经受到广泛重视。内皮祖细胞对维持内皮细胞完整性、促进血管新生有重要作用,而高糖环境对内皮祖细胞数量和功能均有影响,主要使其凋亡增多,数量减少。糖尿病患者伴随存在的氧化应激状态,促使细胞产生过量的ROS进而通过调控凋亡基因,激活凋亡受体等途径,显著增加细胞的凋亡,最终影响血管新生。肿瘤坏死因子(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子,主要参与细胞凋亡和炎症反应的调控,其受体(TNFR1)在细胞凋亡的主要途径死亡受体途径中发挥重要作用。在高糖导致的氧化应激条件下,ROS激活TNFR1进而诱导EPC的凋亡可能是糖尿病血管新生障碍的重要原因之一。因此本实验的研究目的在于,观察体外高糖是否通过氧化应激反应激活TNF受体进而对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPC)凋亡产生影响,探讨高糖对内皮祖细胞影响。方法：1.骨髓EPC的分离、培养和鉴定,倒置相差显微镜连续观察体外培养的EPC的形态、生长及增殖情况。用免疫组织化学和免疫荧光染色作CD34、CD133、VEGFR-2、ac-LDL和UEA-1检测来鉴定EPC并计数。2高糖对EPCs的氧化应激相关产物MDA,GSH,抗O2-的影响。3.高糖及抗氧化剂对EPCs凋亡的影响。流式细胞仪检测,Annexin-V阳性的细胞认为是凋亡细胞,计算细胞凋亡率。4.PCR检测高糖及抗氧化剂对EPCs TNF-αmRNA的表达情况结果：1.骨髓来源的EP、C在体外培养时呈梭形,贴壁生长,二者均表达CD34, CD 133和VEGFR-2表达,且能结合UEA-1并摄取ac-LDL,证明所培养细胞为内皮祖细胞。2.高糖作用24h后,与正常组相比,高糖干预组(30mmol/L,60mmol/L)EPCs的MDA, GSH浓度均无明显差异,作用48h 96h后,MDA, GSH浓度显著增加(P<0.05),均高于对照组,并呈浓度及时间依赖性,15mmol/L高糖组则无明显增加。高糖作用48h,96h后,抗O2-浓度明显减少(P<0.05),呈浓度及时间依赖性。3.流式细胞仪检测细胞早期凋亡表明高糖组凋亡率高于对照组以及TEMPOL干预组(8.29±0.33)%, (13.08±0.68)%vs(2.54±0.47)%,(2.76±0.44)%vs(4.41±0.72)%, (5.12±0.53)%,P<0.05。3.PCR检测TNFR1mRNA含量显示在48h,96h时高糖组表达增多,(1.413±0.115,1.656±0.133 vs 0.982±0.099,0.。975±0.113,P<0.05)TEMPOL能够抑制TNFR-1 mRNA的表达。(1.072±0.126,1.035±0.114 vs 1.413±0.115,1.656±0.133P<0.01)。结论：1.高糖能够引起EPC氧化应激反应增强,抗氧化能力减弱,并呈时间和浓度依赖性。2.高糖能够增加EPC早期凋亡率,抗氧化剂TEMPOL能够抑制高糖引起的凋亡率增高。3.高糖能够诱导EPC增加TNFR-1 mRNA表达,抗氧化剂TEMPOL能抑制这一效应。说明高糖诱导的EPC氧化应激反应可能通过激活TNF受体调控EPC凋亡。
