目的:通过在鹿茸顶端对生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因的组织定位以及GHR基因cDNA的克隆初步阐明这些生长因子的分泌机制及对鹿茸生长的调节作用。在鹿茸生长过程中生长激素(GH)控制着IGF-1的水平,而IGF-1则直接作用于靶细胞,介导GH的生物效应。GH首先与细胞表面特异性受体(GHR)结合形成配体受体复合物,再由受体介导激发一系列生化反应,从而发挥生物学效应。由此揭示鹿茸快速生长整个阶段中一些生长因子对其生长的调节规律,为进一步研究鹿茸快速生长提供一定的数据与方法。方法:(1)设计引物,以鹿茸顶部提取的总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆GHR基因的cDNA,得到克隆片段后回收测序进行同源性比对。(2)提取鹿的DNA,设计引物,扩增GHR、IGF-1、IGF-1R基因,纯化后连接启动子,以T7转录酶进行转录并标记,转录产物作为探针。(3)制作冰冻切片,用原位杂交技术对鹿茸顶端GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表达进行组织定位。(4)以鹿茸顶部不同层提取RNA反转录的cDNA为模板分别对GHR、IGF-1基因扩增,用半定量PCR方法分析他们在各组织层的表达水平。结果:(1)克隆得到了GHR基因的cDNA序列(Genbank登陆号为EU381142),序列全长为1967bp,包括该基因的全部编码序列。GHR蛋白的前体为634个氨基酸序列,对其序列进行分析与对比,鹿GHR基因与牛、羊和人类GHR核苷酸同源性分别为97%,97%和80%,GHR蛋白氨基酸序列同源性分别为97.9%、97.6%和77.3%。(2)对GHR、IGF-1、IGF-1R基因的探针分别标记,纯化,检测探针的浓度,能够达到原位杂交实验所要求的浓度。(3)GHR、IGF-1、IGF-1R基因原位杂交结果显示了阳性信号,进一步表明了鹿茸顶端存在这三个基因的表达。(4)在鹿茸顶端的皮肤层、间叶细胞和软骨膜层、软骨区用半定量PCR(RT-PCR)的方法对GHR、IGF-1基因进行表达水平的相关性分析,结果表明GHR、IGF-1基因在鹿茸顶端的三层中均有表达且在皮肤层和软骨区表达水平较高(P<0.05或P<0.01)。结论:综合整个实验,原位杂交和RT-PCR都表明了在鹿茸顶端各层中均有GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表达。
