GHR、IGF-1、IGF-1R基因在鹿茸顶端的组织定位及鹿GHR基因cDNA克隆

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目的:通过在鹿茸顶端对生长激素受体(GHR)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因的组织定位以及GHR基因cDNA的克隆初步阐明这些生长因子的分泌机制及对鹿茸生长的调节作用。在鹿茸生长过程中生长激素(GH)控制着IGF-1的水平,而IGF-1则直接作用于靶细胞,介导GH的生物效应。GH首先与细胞表面特异性受体(GHR)结合形成配体受体复合物,再由受体介导激发一系列生化反应,从而发挥生物学效应。由此揭示鹿茸快速生长整个阶段中一些生长因子对其生长的调节规律,为进一步研究鹿茸快速生长提供一定的数据与方法。方法:(1)设计引物,以鹿茸顶部提取的总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆GHR基因的cDNA,得到克隆片段后回收测序进行同源性比对。(2)提取鹿的DNA,设计引物,扩增GHR、IGF-1、IGF-1R基因,纯化后连接启动子,以T7转录酶进行转录并标记,转录产物作为探针。(3)制作冰冻切片,用原位杂交技术对鹿茸顶端GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表达进行组织定位。(4)以鹿茸顶部不同层提取RNA反转录的cDNA为模板分别对GHR、IGF-1基因扩增,用半定量PCR方法分析他们在各组织层的表达水平。结果:(1)克隆得到了GHR基因的cDNA序列(Genbank登陆号为EU381142),序列全长为1967bp,包括该基因的全部编码序列。GHR蛋白的前体为634个氨基酸序列,对其序列进行分析与对比,鹿GHR基因与牛、羊和人类GHR核苷酸同源性分别为97%,97%和80%,GHR蛋白氨基酸序列同源性分别为97.9%、97.6%和77.3%。(2)对GHR、IGF-1、IGF-1R基因的探针分别标记,纯化,检测探针的浓度,能够达到原位杂交实验所要求的浓度。(3)GHR、IGF-1、IGF-1R基因原位杂交结果显示了阳性信号,进一步表明了鹿茸顶端存在这三个基因的表达。(4)在鹿茸顶端的皮肤层、间叶细胞和软骨膜层、软骨区用半定量PCR(RT-PCR)的方法对GHR、IGF-1基因进行表达水平的相关性分析,结果表明GHR、IGF-1基因在鹿茸顶端的三层中均有表达且在皮肤层和软骨区表达水平较高(P<0.05或P<0.01)。结论:综合整个实验,原位杂交和RT-PCR都表明了在鹿茸顶端各层中均有GHR、IGF-1、IGF-1R基因的表达。
摘要第4-5页
ABSTRACT第5-6页
第一章 文献综述第10-22页
    1.1 鹿茸角的生长发育规律第10-11页
        1.1.1 鹿茸生长机制第10页
        1.1.2 鹿茸生长点在其顶端的证明第10-11页
        1.1.3 影响鹿茸生长的因素第11页
    1.2 鹿茸的化学成分、组织结构和药用价值第11-14页
        1.2.1 鹿茸的化学成分第12页
        1.2.2 鹿茸的组织结构第12-14页
        1.2.3 鹿茸的药用价值第14页
    1.3 鹿茸生长与激素和生长因子的关系第14-19页
        1.3.1 血浆中睾酮、雌二醇的浓度与鹿茸生长的关系第15-16页
        1.3.2 生长因子与鹿茸生长的关系第16-19页
    1.4 原位杂交研究进展第19-21页
    1.5 本研究的目的及意义第21-22页
第二章 GHR 基因的CDNA 克隆及序列分析第22-30页
    2.1 材料与方法第22-25页
        2.1.1 试验材料第22页
        2.1.2 总RNA 的提取(Trizol 法)第22-23页
        2.1.3 引物设计第23页
        2.1.4 反转录第23页
        2.1.5 确定提取RNA 纯度第23-24页
        2.1.6 PCR 扩增第24页
        2.1.7 扩增片段的分离和克隆第24页
        2.1.8 克隆产物的鉴定第24-25页
        2.1.9 序列分析第25页
    2.2 结果第25-28页
        2.2.1 鹿茸顶端组织提取RNA 的完整性第25页
        2.2.2 提取RNA 纯度的检测第25-26页
        2.2.3 Ta 对GHR 引物扩增效率的影响第26页
        2.2.4 MgCl_2 浓度对GHR 引物扩增效率的影响第26页
        2.2.5 重组质粒的PCR 初步鉴定第26-27页
        2.2.6 重组质粒的酶切鉴定第27页
        2.2.7 克隆所得序列、Genbank 登陆号及同源性比对分析第27-28页
    2.3 讨论第28-30页
第三章 GHR、IGF-1、IGF-1R 基因在鹿茸顶端的组织定位第30-39页
    3.1 材料与方法第30-35页
        3.1.1 试验材料第30页
        3.1.2 DNA 的提取第30-31页
        3.1.3 GHR、IGF-1、IGF-1R 基因探针的制备第31-33页
        3.1.4 估计探针产量第33-34页
        3.1.5 冰冻切片的制备第34页
        3.1.6 原位杂交第34-35页
    3.2 结果第35-37页
        3.2.1 GHR、IGF-1、IGF-1R 基因PCR 产物回收后的电泳检测图第35-36页
        3.2.2 GHR、IGF-1、IGF-1R 基因回收后的浓度测定第36页
        3.2.3 估计探针产量第36-37页
        3.2.4 原位杂交第37页
    3.3 讨论第37-39页
第四章 半定量RT-PCR 法检测鹿茸顶端GHR、IGF-1 基因的表达水平第39-45页
    4.1 材料与方法第39-40页
        4.1.1 试验材料第39页
        4.1.2 总RNA 的提取第39页
        4.1.3 反转录(参照2.1.4)第39页
        4.1.4 PCR 扩增第39-40页
        4.1.5 GHR 和IGF-1 基因的半定量检测第40页
        4.1.6 数据分析第40页
    4.2 结果第40-44页
        4.2.1 鹿茸各部位所提的RNA第40-41页
        4.2.2 确定反应的循环次数第41-42页
        4.2.3 各部位GHR、IGF-1 和β-actin 基因的扩增条带第42页
        4.2.4 GHR、IGF-1 基因在鹿茸顶端各层mRNA 表达丰度的检测第42-44页
    4.3 讨论第44-45页
结论第45-46页
参考文献第46-53页
附录第53-61页
致谢第61-62页
作者简介第62页
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