补体调节蛋白CD55在糖尿病神经病理性疼痛中作用的研究

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研究背景:糖尿病神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain, DNP)的发病率很高,是糖尿病慢性并发症中最常见的一种,同时也是临床最常见的神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)种类之一。其临床特征可表现为以下几种:自发性疼痛、诱发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏以及异常性疼痛等。DNP患者肢体远端疼痛剧烈而持久,对标准的镇痛治疗效果不好。近年来相关研究报道证明:NPP的发生与补体异常激活密切相关,活化的补体蛋白在NPP模型动物的形成和发展中发挥重要作用,补体C3参与了NPP模型动物慢性疼痛的发生发展,且给予补体抑制剂抑制补体C3的表达后,可以逆转CCI模型大鼠的NPP症状。但是,NPP时补体异常激活的启动机制目前尚不清楚。正常情况下,机体内活化的补体可以被补体调节蛋白迅速灭活,并终止其级联反应,CRP的功能状况可以决定补体级联反应的强度,因此我们猜测,CRP具有成为NPP补体异常激活启动机制重要因素的基本条件。目前关于NPP的研究主要集中在外周神经损伤模型,如CCI模型、SNI模型以及SNL模型等,而DNP的发生是否也与补体的异常激活密切相关,同时CRP是否在其补体的异常激活过程中起到启动作用,目前尚无研究。目的:本实验拟应用不同剂量链脲佐菌素诱导DNP小鼠模型,通过观察小鼠DM模型成功率、发生NPP的比率以及28d生存率,选择制作DNP小鼠模型的最佳STZ剂量。同时观察DNP模型小鼠脊髓背角补体C3以及补体调节蛋白CD55的表达变化,寻找NPP发生发展过程中脊髓背角补体异常激活的“激发点”。方法:实验分三部分:1、探讨诱导DNP小鼠模型的最佳STZ剂量成年健康雄性C57BL/6J小鼠85只,体重18-20g,随机分为正常对照组(n=10)和5个不同剂量STZ实验组(n=15),观察STZ注射前及注射后3、7、14、21d小鼠血糖值变化;注射前及注射后3、7、14、21、28d小鼠机械痛阈值及热刺痛阈值变化以及小鼠的28d生存率。2、DNP小鼠脊髓背角补体C3mRNA及蛋白的表达成年健康雄性C57BL/6J小鼠90只,随机分为正常对照组(n=15)和制模组(DM,n=75),制模组小鼠根据不同时间点,又分为5个亚组:DM3、7、14、21、28d组,每组各15只小鼠。按照分组在STZ注射前以及STZ注射后规定的各时间点测定小鼠末梢血糖、机械痛阈值和热刺痛阈值。采用免疫组织化学染色法测定L4-6节段脊髓背角补体C3阳性细胞的情况;采用RT-PCR技术测定L4-6节段脊髓背角补体C3mRNA水平。3、DNP小鼠脊髓背角补体调节蛋白CD55mRNA及蛋白的表达实验分组以及采用的测量方法和技术均同第二部分。结果:1、腹腔注射STZ后DM小鼠模型制作成功的标准为:STZ注射后的3、7、14、21d检测小鼠末梢血糖值均>16.7mmol/L。DM小鼠与对照组小鼠比较,毛色暗淡粗糙,饮水量及尿量明显增多,体重减轻。发生NPP的小鼠其行为学检测出现了显著的疼痛行为学的变化:机械痛阈值和热刺痛阈值明显降低,与对照组和基础值比较均具有显著的统计学差异。A-E各组糖尿病成模率均>86.7%,C组NPP成模率(66.7%)高于其余各组,E组28d生存率最低(46.7%)。2、与对照组比较,DM组小鼠STZ注射后21d脊髓背角补体C3蛋白表达显著增加,补体C3阳性细胞数目增加;STZ注射后14d脊髓补体C3mRNA表达显著上调,与DNP小鼠出现NPP症状的时间相一致。3、与对照组比较,DM组小鼠STZ注射后7d脊髓背角补体调节蛋白CD55mRNA及蛋白表达都显著降低,并持续至STZ注射后28d,且有进行性降低趋势。结论:1、腹腔注射STZ诱导DNP模型最合适的注射剂量为120mg/kg体重,该剂量小鼠DNP模型成功率最高。2、DNP小鼠模型同外周神经损伤诱发的NPP模型相似,其NPP的发生和发展与补体的异常激活密切相关。3、补体调节蛋白CD55与DNP的发生发展有密切关系,脊髓背角CD55的表达下调先于模型小鼠出现NPP症状及脊髓背角补体C3表达增加发生,可能是NPP是补体异常激活的上游机制。
缩略语表第4-6页
英文摘要第6-8页
中文摘要第9-12页
第一章 前言第12-14页
第二章 链脲佐菌素剂量对 C57BL/6J 小鼠糖尿病神经病理性疼痛诱导效应的影响第14-22页
    2.1 材料和方法第14-17页
    2.2 实验结果第17-20页
    2.3 讨论第20-22页
第三章 糖尿病神经病理性疼痛小鼠脊髓背角补体 C3 mRNA 及蛋白质的表达第22-36页
    3.1 材料和方法第22-31页
    3.2 实验结果第31-34页
    3.3 讨论第34-36页
第四章 糖尿病神经病理性疼痛小鼠脊髓背角补体调节蛋白 CD55 mRNA 及蛋白蛋白质的表达第36-43页
    4.1 材料和方法第36-38页
    4.2 实验结果第38-42页
    4.3 讨论第42-43页
全文讨论第43-45页
全文总结第45-46页
参考文献第46-50页
文献综述第50-57页
    参考文献第54-57页
攻读硕士期间发表的论文第57-58页
致谢第58页
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