云斑天牛触角cDNA文库的构建及相关嗅觉蛋白的表达及功能分析

云斑天牛论文 cDNA文库论文 ESTs序列分析论文 气味结合蛋白论文 化学感受蛋白论文 基因克隆论
论文详情
自然界中,昆虫对化学信号物质的感知主要通过两种化学感受机制:嗅觉和味觉。借助特定的化学感觉机制,昆虫的嗅觉系统能够感知其周围环境中的大量纷繁复杂的化学信息,完成寄主定位、寻找食物配偶、躲避天敌的捕捉、避免有毒物质以及寻找繁殖场所等多种生理行为。阐明昆虫的化学感受机理,可以加深对昆虫与植物、昆虫与昆虫之间相互关系的了解,帮助我们设计新的方法来进行害虫治理。云斑天牛Batocera horsfieldi (Hope)属于鞘翅目天牛科,是一种重要的蛀干害虫,主要以幼虫蛀食树干和成虫补充营方式养危害树木。由于云斑天牛蛀害,导致杨树树势衰弱或全株枯死;同时还造成了杨树材质的损害,造成极大的经济损失。近年来,对云斑天牛的行为学研究比较多,但对云斑天牛嗅觉识别机制的分子机制研究,国内外尚未见报道。为此我们通过分子生物学手段构建cDNA文库并结合批量ESTs测序,对云斑天牛触角功能基因进行了分析。通过对主要的触角气味结合蛋白OBPs和化学感受蛋白CSPs进行基因克隆,分析其在不同组织中的转录表达谱特征,以及对OBP2和CSP2蛋白的表达纯化,初步探讨了其生理功能。主要研究结果如下:1云斑天牛成虫触角cDNA文库的构建通过LD-PCR技术合成全长ds-cDNA,电泳后,对0.3-0.6kb ds-cDNA和0.6-1kbds-cDNA分别割胶回收,连接到pDNR-LIB载体上。对扩增文库分别采用PCR扩增和蓝白斑筛选的方法进行鉴定,本研究构建的云斑天牛0.3-0.6kb cDNA文库滴度为6.4×105cfu/mL,库容量为8.9×105克隆,得重组率94.5%;0.6-1kb cDNA文库滴度为4.1×106cfu/mL,库容量为5.8×106克隆,得重组率93.2%,且序列基本上均为全长,这充分说明两个定向片段大小的文库构建得较好。通过测序,成功得到了有效ESTs序列692条,经拼接后分别得到‘’Contigs"和‘’Singlets"(?)序列分别为79个和323个,其中功能基因246个,同源但无注释功能等的基因34个。从拼接后的BLASTx结果看,包括68条云斑天牛气味结合蛋白及化学感受相关的基因,去除重复的序列,得到了4个Odorant Binding proteins (OBPs)机因,3个Chemosensory Proteins (CSPs)基因,2个Pheromone binding proteins (PBP)基因以及9个Minus-OBP基因,为广泛开展云斑天牛分子生物学研究提供了重要的参考和依据。2云斑天牛气味结合蛋白和化学感受蛋白的克隆及序列分析利用RT-PCR技术克隆得到云斑天牛3个普通气味结合蛋白(GOBP)基因BhorGOBP1、BhorGOBP2及BhorGOBP3,分别编码142、137和125个氨基酸,预测N-末端分别包含20,19和20个氨基酸组成的信号肽序列。这三个基因编码的氨基酸序列和鞘翅目昆虫GOBP的氨基酸序列比对同源性较高(50%左右),但是BhorGOBP1、BhorGOBP2和BhorOBP3的同源性只有12.68%,说明它们属于不同的GOBP类群;同时克隆得到3个化学感受蛋白(CSP)基因BhorCSP1、BhorCSP2及BhorCSP3的ORF全长,分别编码127、130和125个氨基酸,预测N-末端分别包含20、19和20个氨基酸组成的信号肽序列,所得到的3个CSP基因序列已提交到GenBank,其登录号分别为HQ587041, HQ587040和HQ587042。从序列连配的结果我们发现,在CSPs中存在有3个高度保守的区域结构,分别是位于N-端的Motif A区YTTKYDN[V/I][N/D][L/V] DEIL,中心的Motif B区DGKELKXX [I/L]PDAL,和位于C-端的Motif C区KYDP,进一步分析表明,位于第53、110、123位置的芬芳族残基,以及位于第91/92位的(glutamine/lysine)和129/130位的(lysine/tyrosine)均高度保守。3云斑天牛气味结合蛋白和化学感受蛋白的时空表达谱研究依据已克隆得到的云斑天牛Batocera horsfieldi气味结合蛋白OBPs和化学感受蛋白CSPs基因全长序列设计特异引物,利用RT-PCR和Real Time-PCR技术对云斑天牛主要OBPs基因和CSPs基因在云斑天牛成虫的不同组织及羽化后各个发育阶段的转录表达谱进行了研究。基于云斑天牛成虫期RT-PCR的表达谱分析发现,3个OBP基因和3个CSP基因在头部(去除触角)均不表达,而在触角、下颚须、下唇须、翅、足、腹部均有表达。Q-PCR结果显示3个OBP基因在触角中在不同发育阶段的表达量要远高于3个CSP基因;OBPs和CSPs在雄虫不同组织其表达量要高于雌虫(无论交配与否);在羽化后1-5天以及羽化后30天左右OBPs和CSPs的表达量较高,远高于中间时期的表达量。结果表明BhorCSPs除了嗅觉功能外,可能还在云斑天牛感受外界化合物的过程中发挥着其它重要作用,其在雌雄虫中不同的表达量及不同时期表达量的不同也表明OBPs和CSPs在雄虫寻找配偶及雌虫寻找补充营养寄主及产卵场所的过程中发挥着重要的功能。4云斑天牛气味结合蛋白OBP2和化学感受蛋白CSP2的原核表达纯化成功构建了云斑天牛BhorOBP2和BhorCSPSP2(?)勺原核表达质粒,由于目的蛋白含有二硫键,我们最终选择以pET32a原核表达载体来表达目的蛋白,pET32a融合表达系统含有一个硫氧还蛋白标签(Trx),该标签不仅可以增加蛋白可溶性,而且能够催化二硫键的正确形成,因此非常适合含有二硫键的OBPs(3对)和CSPs(2对)蛋白的表达;同时,我们对pET32a进行了人工改造,将pET32a载体自带的Thrombin酶切位点的识别序列突变掉,然后在目的蛋白基因的起始密码子前面加上一个Thrombin识别序列,同时为了将该序列和目的蛋白保持一定的空间距离,在二者之间还添加了一段Linker序列(GGGGSGGG),最终使切除的标签从分子量和pI均和目的蛋白有一定的差别,利于后续的纯化。通过对温度以及IPTG浓度的优化,我们最终确定了pET32a-BhorOBP2/CSP2的最优的可溶性表达条件:16℃,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导过夜。经镍离子亲和层析和Resource S/Q(阳/阴)离子交换柱及Superdex75凝胶柱纯化得到纯的蛋白,为制作多克隆抗体,进行嗅觉蛋白在云斑天牛触角嗅觉感器中的免疫定位和荧光竞争结合实验检测其对不同来源种类的气味化学物质的结合能力奠定了物质基础。
摘要第9-12页
Abstract第12-15页
缩略语表第16-17页
第一章 文献综述第17-46页
    1 云斑天牛的研究现状第17-20页
        1.1 云斑天牛生活史第17-18页
        1.2 天牛成虫与植物之间的化学联系第18-20页
            1.2.1 天牛的寄主信息化学物质第18-19页
            1.2.2 天牛对寄主的识别定位机制第19页
            1.2.3 植物挥发性物质对天牛行为的影响第19-20页
    2 昆虫的嗅觉第20-27页
        2.1 昆虫对气味分子的识别第21-23页
            2.1.1 昆虫的嗅觉感器第21-23页
            2.1.2 昆虫气味结合蛋白对气味分子的探测与结合第23页
        2.2 气味结合蛋白和气味分子复合物在体内的运输第23-26页
            2.2.1 气味分子在体内的运输第23-24页
            2.2.2 气味分子与气味受体的结合第24-25页
            2.2.3 气味分子的失活第25-26页
        2.3 嗅觉编码的电化学信号传导第26-27页
    3 昆虫嗅觉相关蛋白第27-38页
        3.1 气味结合蛋白(Odorant Bindingproteins,OBPs)第27-33页
            3.1.1 气味结合蛋白的种类和特征第27-30页
            3.1.2 气味结合蛋白与信息素分子的结合释放机制第30-32页
            3.1.3 气味结合蛋白的功能第32-33页
            3.1.4 气味结合蛋白研究意义第33页
        3.2 化学感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)第33-36页
            3.2.1 化学感受蛋白的基本特征第34页
            3.2.2 化学感受蛋白的表达分布第34页
            3.2.3 化学感受蛋白的分子结构第34-35页
            3.2.4 化学感受蛋白的生理功能第35-36页
        3.3 气味受体(Olfactory Receptors,Ors)第36-37页
        3.4 气味降解酶(Odorant Degrading Enzymes,ODEs)第37-38页
    4 嗅觉相关蛋白的结构研究第38-40页
    5 cDNA文库及表达序列标签技术(Expressed sequence tag,ESTs)第40-44页
        5.1 构建cDNA文库的用途及意义第40-41页
        5.2 cDNA文库构建方法第41-42页
        5.3 表达序列标签(ESTs)技术第42-43页
            5.3.1 ESTs原始数据的预处理第42页
            5.3.2 ESTs序列的聚类、拼接及非冗余EST序列的获得第42-43页
            5.3.3 序列同源性比较分析第43页
        5.4 生物信息学在EST分析中的应用第43-44页
    6 课题研究内容及目的意义第44页
    7 课题的创新之处第44-45页
    技术路线第45-46页
第二章 云斑天牛触角cDNA文库的构建第46-65页
    1 材料和方法第46-55页
        1.1 实验材料第46-48页
            1.1.1 供试昆虫第46-47页
            1.1.2 实验试剂第47页
            1.1.3 实验仪器第47页
            1.1.4 所用引物序列及载体第47-48页
        1.2 试验方法第48-55页
            1.2.1 供试昆虫云斑天牛触角总RNA的提取第48-49页
            1.2.2 云斑天牛触角cDNA文库的构建第49-54页
            1.2.3 云斑天牛触角cDNA文库EST的生物信息学分析第54-55页
    2 结果与分析第55-63页
        2.1 云斑天牛触角总RNA质量检测第55页
            2.1.1 云斑天牛触角总RNA完整性检测第55页
            2.1.2 云斑天牛触角总RNA浓度测定第55页
        2.2 云斑天牛触角cDNA文库构建的结果与分析第55-58页
            2.2.1 云斑天牛cDNA第二链的合成(LD-PCR)第55-56页
            2.2.2 ds cDNA Sfi Ⅰ酶切及分级分离纯化第56页
            2.2.3 云斑天牛cDNA文库滴度测定第56-57页
            2.2.4 云斑天牛cDNA文库克隆重组率和插入片段长度检测第57-58页
        2.3 云斑天牛触角cDNA文库EST的生物信息学分析第58-63页
            2.3.1 测序拼接结果分析第58-59页
            2.3.2 EST序列同源性比较及基因功能分析第59-61页
            2.3.3 与云斑天牛嗅觉及化学感受相关的基因第61-63页
    3 讨论第63-65页
        3.1 云斑天牛总RNA的提取第63页
        3.2 云斑天牛触角全长cDNA文库质量评价第63-64页
        3.3 云斑天牛文库EST序列的生物信息学分析第64-65页
第三章 云斑天牛气味结合蛋白基因的克隆和序列分析第65-78页
    1 材料和方法第66-71页
        1.1 实验材料第66页
        1.2 触角总RNA的提取和cDNA第一链的合成第66-67页
        1.3 引物设计第67-68页
        1.4 PCR扩增及其产物的克隆第68-70页
            1.4.1 PCR反应体系及程序第68页
            1.4.2 PCR产物回收第68-69页
            1.4.3 T/A连接第69页
            1.4.4 重组质粒转化感受态细胞第69页
            1.4.5 阳性克隆检测及质粒提取第69-70页
        1.5 云斑天牛GOBP基因序列分析第70-71页
    2 结果与分析第71-77页
        2.1 云斑天牛GOBP基因的PCR扩增第71页
        2.2 阳性克隆鉴定第71页
        2.3 云斑天牛GOBP基因的序列分析第71-77页
    3 讨论第77-78页
第四章 云斑天牛化学感受蛋白基因的克隆和序列分析第78-89页
    1 材料和方法第79-81页
        1.1 实验材料第79页
        1.2 触角总RNA的提取和cDNA第一链的合成第79页
        1.3 引物设计第79页
        1.4 PCR扩增及其产物的克隆第79-80页
            1.4.1 PCR反应体系及程序第79页
            1.4.2 PCR产物回收第79页
            1.4.3 T/A连接第79页
            1.4.4 重组质粒转化感受态细胞第79页
            1.4.5 阳性克隆检测及质粒提取第79-80页
        1.5 云斑天牛CSP基因序列分析第80-81页
    2 结果与分析第81-87页
        2.1 云斑天牛CSP基因的PCR扩增第81页
        2.2 阳性克隆鉴定第81-82页
        2.3 云斑天牛CSPs基因的序列分析第82-87页
    3 讨论第87-89页
第五章 云斑天牛OBPs和CSPs基因的转录时空表达研究第89-99页
    1 材料和方法第90-92页
        1.1 实验材料第90页
        1.2 触角总RNA的提取和cDNA第一链的合成第90页
        1.3 引物设计第90-91页
        1.4 RT-PCR检测云斑天牛OBPs和CSPs基因的组织分布检测第91页
        1.5 实时定量PCR检测云斑天牛OBPs和CSPs基因的时空分布第91-92页
    2 结果与分析第92-97页
        2.1 云斑天牛OBPs和CSPs基因的组织分布第92-93页
        2.2 云斑天牛OBPs和CSPs基因的时空表达谱第93-97页
    3 讨论第97-99页
第六章 云斑天牛OBP2和CSP2原核表达载体的构建及蛋白纯化第99-129页
    1 材料和方法第100-110页
        1.1 实验材料第100-101页
        1.2 构建原核表达载体pET-32a(+)-BhorOBP2/BhorCSP2第101-110页
            1.2.1 pET-32a(+)的改造第102-105页
            1.2.2 构建原核表达载体pET-32a(+)-BhorOBP2/BhorCSP2第105-107页
            1.2.3 目的蛋白的原核表达第107页
            1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)第107页
            1.2.5 融合蛋白的大量表达第107页
            1.2.6 融合蛋白的纯化第107-110页
            1.2.7 目的蛋白的表征第110页
    2 结果与分析第110-127页
        2.1 不含Thrombin酶切位点的pET-32a(+)载体的获得第110-111页
        2.2 原核表达载体pET-32a(+)-BhorOBP2/BhorCSP2的构建第111-112页
        2.3 融合蛋白pET-32a(+)-BhorOBP2/BhorCSP2的表达条件摸索及可溶性鉴定第112-114页
        2.4 融合蛋白pET-32a(+)-BhorOBP2/BhorCSP2的大量表达及纯化第114-125页
            2.4.1 pET-32a(+)-BhorOBP2融合蛋白的纯化第114-121页
            2.4.2 pET-32a(+)-BhorCSP2融合蛋白的纯化第121-125页
        2.5 BhorOBP2蛋白表征第125-127页
            2.5.1 BhorOBP2融合蛋白的质谱分析第125-127页
            2.5.2 BhorOBP2融合蛋白的圆二色谱分析第127页
    3 讨论第127-129页
第七章 结论与展望第129-132页
    1 结论第129-131页
        1.1 云斑天牛触角cDNA文库的构建第129-130页
        1.2 云斑天牛嗅觉相关基因的克隆和序列分析第130页
        1.3 云斑天牛嗅觉相关基因的时空表达谱分析第130-131页
        1.4 云斑天牛嗅觉基因蛋白的表达和纯化第131页
    2 展望第131-132页
参考文献第132-144页
在读期间发表科研论文第144-145页
致谢第145页
论文购买
论文编号ABS548494,这篇论文共145页
会员购买按0.30元/页下载,共需支付43.5
不是会员,注册会员
会员更优惠充值送钱
直接购买按0.5元/页下载,共需要支付72.5
只需这篇论文,无需注册!
直接网上支付,方便快捷!
相关论文

点击收藏 | 在线购卡 | 站内搜索 | 网站地图
版权所有 艾博士论文 Copyright(C) All Rights Reserved
版权申明:本文摘要目录由会员***投稿,艾博士论文编辑,如作者需要删除论文目录请通过QQ告知我们,承诺24小时内删除。
联系方式: QQ:277865656