植物转基因技术已成为当今植物分子生物学基础研究和现代遗传育种应用研究领域中不可或缺的重要手段和方法之一。经过多年的努力,人们已建立和完善了多种植物遗传转化方法,在多种植物中成功实现了基因转化。其中,根癌农杆菌介导的植物基因遗传转化是使用最为广泛的一种方法。但是农杆菌转化法具有受体基因型依赖性,使之不能有效地转化很多优良作物品种。作为单子叶模式植物,水稻在基础科研和粮食安全中的地位自是不言而喻。同时,它也是首个建立农杆菌介导的转基因体系的禾本科作物。在此基础上,其他作物的转化体系才相继建立。但是经过多年的努力,大部分籼稻品种的转化效率依然较低,大大限制了籼稻特异基因的功能研究和籼稻品种的转基因遗传改良。现在人们已经意识到,仅仅通过优化组培条件已不能克服籼稻转化效率低下的问题,进一步提高转化效率的关键在于侵染相关植物基因的利用,这就需要我们了解农杆菌介导的侵染过程,搞清楚植物细胞对农杆菌侵染的反应。本研究以不同粳稻和籼稻品种为转化受体,比较了它们对农杆菌侵染的敏感性的差异；并利用生物芯片方法,检测在农杆菌介导的侵染过程中,粳稻与籼稻代表品种之间的基因表达差异,以期找到在两个亚种间呈现差异表达的基因。本研究获得的主要研究结果如下：1.不同粳稻品种间转化效率的差别是由T-DNA整合效率的差别引起的。与粳稻相比,在农杆菌侵染过程中,籼稻每一步的效率都要低一些,因此籼稻的短暂侵染效率和稳定侵染效率都比粳稻的低。但籼稻中农杆菌介导的遗传转化的限速步骤依然是T-DNA整合。2.选取了2个具有代表性的粳稻和籼稻品种——日本晴(Nip)和珍汕97(ZS),对其成熟胚来源的胚性愈伤分别用农杆菌进行侵染,在侵染前及侵染后1小时、6小时、12小时、24小时分别取样,检测其全基因组水平的基因表达情况。基因组DNA (gDNA)杂交分析表明,Nip和ZS在侵染过程中对农杆菌敏感性的差异很可能不是由两者之间基因组序列上的差异引起的,而是由基因表达上的差异造成的。3.虽然从RNA水平上说在Nip愈伤里表达的基因更多,在Nip愈伤中特异表达的基因也比ZS中的多,但农杆菌侵染后呈现差异表达的基因则是ZS愈伤中多一些。只有3,892个基因同时在两个品种中差异表达,占总的差异表达基因数目(11,105)的35%。说明农杆菌侵染对愈伤中基因表达的影响具有品种特异性。4.在Nip愈伤中,差异表达的基因多数为上调表达；而在ZS愈伤中有更多差异下降表达的基因,也有更多既差异下降表达又上调表达的基因。5.大多数基因的差异表达变化发生在侵染的早期阶段,就是侵染后6小时之内。在侵染后最初6小时,既有一些基因上调表达,又有一些基因下降表达；接下来的18小时内,农杆菌侵染主要诱导基因下调表达,虽然最后12小时内一些基因被上调表达。6.植物抗病防御相关基因在农杆菌与水稻细胞互作的过程中发挥重要作用。它们在Nip和ZS愈伤中都既被诱导上升表达,也被抑制表达；但也有一些这类基因在Nip和ZS愈伤之间呈现差异表达。一些抗病基因在ZS愈伤中很早就被诱导表达,或者一直处于激活状态；但在Nip愈伤中则是被抑制表达的,这可能导致了两者在侵染效率上的差异。7.一些与农杆菌侵染直接相关的基因在Nip和ZS愈伤之间呈现差异表达。参与细胞分裂和细胞周期,DNA复制、重组和修复,微管介导的运动,泛素-26S蛋白酶体降解系统,生长素刺激应答及编码组蛋白的基因在ZS愈伤中被强烈抑制表达；在Nip愈伤中,这些基因的表达水平没有明显的降低,有些还被诱导上升表达。这进一步降低了籼稻的农杆菌转化效率。这些在农杆菌侵染过程中发挥重要作用的植物因子是我们进一步研究的重点,也是通过基因工程手段用以提高转化效率的基础。
