2型糖尿病肾病大鼠模型的建立及慢病毒载体介导siRNA对Ⅰ型胶原抑制作用的研究

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肾脏纤维化是糖尿病肾病等慢性肾脏疾病终末期的病理变化特征,其本质是细胞外基质的过度积聚,其中Ⅰ型胶原的过度表达在该过程中起到重要作用。利用RNA干涉技术下调Ⅰ型胶原基因的过度表达,以期成为延缓肾脏纤维化的新方法。第一部分2型糖尿病肾病大鼠模型的建立目的在原有高糖高脂饮食+链脲佐菌素(STZ)造模方法的基础上进一步缩短造模时间,优化模型,使模型更加接近于人类2型糖尿病肾脏病,为探索其机制及治疗方法提供一个更好的动物模型。方法4周的雄性SD大鼠,随机分为对照组(A组,n=15)和模型组(B组,n=15)。A组为普通饮食,B组采用高糖高脂饲料+5%葡萄糖饮水喂养,诱发胰岛素抵抗,2周后,按照30 mg/kg的剂量腹腔注射STZ,连续注射3天,诱发持续高糖血症,继续观察6周。每2周测定大鼠的体质量、尿蛋白及尿白蛋白排泄率、血糖,实验及注射STZ前、注射6周后采集血样,测血肌酐、血尿素氮及血胰岛素。结果实验前2组大鼠的体质量、血糖、血胰岛素、血肌酐和尿素氮无统计学差异(P>0.05)。高糖高脂饲料+5%葡萄糖饮水2周后,B组血胰岛素较A组有明显的升高(P<0.01),完成STZ注射24h后,B组血糖有明显升高(P<0.01)。其肾脏改变特点,临床上表现为持续蛋白尿,病理改变为系膜细胞增生、系膜区基质增多。结论高糖高脂饲料+5%葡萄糖饮水+连续小剂量STZ可建立理想的2型糖尿病肾病大鼠模型,该模型具有人类2型糖尿病肾病的主要表型特征和相似的发病过程,且造模时间相对缩短。第二部分I型胶原慢病毒干扰载体的构建及其在糖尿病肾病大鼠肾脏转染的研究目的在体外构建并筛选出靶向I型胶原的有效RNA干扰慢病毒载体,研究其在活体糖尿病肾病大鼠肾脏的基因转染及表达情况。方法设计3条siRNA序列并合成双链DNAoligo,制备目的基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染目的细胞,利用RT- PCR的方法检测目的基因I型胶原的表达情况,从而筛选出有效的干扰靶点。经肾动脉注射I型胶原慢病毒干扰载体,在注射后第15天处死大鼠,观察绿色荧光检测报告基因的表达。结果酶切鉴定及测序结果均提示siRNA序列成功连接入载体中。RT- PCR结果提示1号靶点的干扰效率最高,达到77%左右。肾脏组织可观察到绿色荧光。结论I型胶原靶向RNA干扰慢病毒载体构建成功,能有效抑制目的细胞中I型胶原的表达且有效而稳定的将外源基因导入活体大鼠肾脏。第三部分慢病毒载体介导siRNA对糖尿病肾病大鼠I型胶原抑制作用的研究目的分析I型胶原慢病毒干扰载体对糖尿病肾病大鼠体内抑制I型胶原的效果;方法14只雄性患有糖尿病肾病Sprague-Dawley大鼠随机分为三组:A组为I型胶原慢病毒干扰载体干涉组(n=6);B组为空病毒对照组(n=6);C组为空白对照组(n=2)。利用肾动脉注射方法,每只I型胶原慢病毒干扰载体干涉组及空病毒对照组糖尿病肾病大鼠分别注射I型胶原慢病毒干扰载体、空病毒200ul、空白组注射等量生理盐水。大鼠在注射后两周处死,取得肾脏。用荧光定量PCR和免疫组化Western blot分别检测I型胶原mRNA和蛋白表达量的改变,验证所设计的I型胶原慢病毒干扰载体的抑制效应。结果与空病毒组及空白组比较, I型胶原慢病毒干扰载体组mRNA表达分别下调38-48 %( P< 0.05) ,蛋白表达分别下调10-22 %( P < 0.05),空病毒组与空白组比较无差别。结论I型胶原慢病毒干扰载体对糖尿病肾病大鼠肾脏I型胶原有明显的抑制效应,可能成为防止糖尿病肾病进程的新的治疗方法。
摘要第6-8页
Abstract第8-9页
缩略词表第10-11页
前言第11-12页
第一部分 2 型糖尿病肾病大鼠模型的建立第12-28页
    前言第12页
    材料第12-13页
    方法第13-17页
    结果第17-27页
    讨论第27-28页
第二部分 I型胶原慢病毒干扰载体的构建及其在糖尿病肾病大鼠肾脏转染的研究第28-38页
    前言第28-29页
    材料第29-31页
    方法第31-33页
    结果第33-37页
    讨论第37-38页
第三部分 慢病毒载体介导siRNA对糖尿病肾病大鼠I型胶原抑制作用的研究第38-53页
    前言第38页
    材料第38-39页
    方法第39-45页
    结果第45-52页
    讨论第52-53页
全文小结第53-54页
参考文献第54-57页
综述1第57-63页
    参考文献第61-63页
综述2第63-69页
    参考文献第66-69页
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明第69-70页
致谢第70页
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