目的:作为皮肤的附属器官,毛发具有重要的生理学与社会学功能。毛发缺失或分布异常给患者带来很大的心理负担。目前对毛发生长机制的研究主要集中于毛囊。毛乳头细胞(Dermal papilla cell,DPC)是位于毛囊基底部的一群真皮源性细胞,它们是一簇特化的成纤维细胞(specialized fibroblast),其显著的生物学特性为体内外表现为凝集性的生长方式及体内外具有诱导毛囊形成的能力,并在毛囊的形态学发生及其周期性生长调控中处于中心环节。而在多次传代后,这种特性就会消失。毛乳头细胞的生物学作用是通过一系列信号分子通路、多种细胞生长因子完成的。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)结构与胰岛素类似,能刺激黑素细胞、上皮细胞及毛囊的生长。成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor7,FGF7)又称角质形成细胞生长因子,可刺激角质形成细胞和其它上皮细胞的增殖。毛乳头细胞不仅对诱导和维持毛囊的周期性循环必不可少,毛乳头的大小也决定了毛囊的大小和毛囊生长期的长短。甘草是传统中药养发生发产品中使用频率较高的药物和添加成分,其主要成分为甘草酸,甘草提取物可促进体外培养的鼠触须毛囊生长。复方甘草酸苷(商品名:美能)的主要成分为甘草酸苷即β-甘草酸,被广泛用于皮肤病和肝病的治疗。临床实验发现复方甘草酸苷对斑秃治疗有效,其诱导毛发生长的机制尚不明确,其对体外培养的人毛乳头细胞的作用还未见报道。糖皮质激素应用于斑秃治疗迄今已有60余年的历史,是目前治疗斑秃最为常用、可靠及有效的方法之一。其主要机制可能与抗炎及免疫抑制有关,但对人毛乳头细胞的作用还未见报道。为观察体外毛乳头细胞的生物学特性,及其与IGF-1和FGF7的关系,复方甘草酸苷和地塞米松对毛乳头细胞的影响,我们对人头皮毛乳头进行分离培养,并检测两种生长因子分别在凝集性、非凝集性生长的毛乳头细胞中的表达,以及IGF-1和复方甘草酸苷、地塞米松对毛乳头细胞增殖的影响,为临床筛选刺激毛囊及毛发生长的药物提供实验基础。方法:1毛乳头细胞的分离培养采用“二步酶消化法”分离培养正常人毛乳头,观察体外培养毛乳头细胞形态和生长情况,并行α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)免疫组化染色鉴定。2采用免疫组化法分别检测第3代和第9代培养的毛乳头细胞IGF-1、FGF7蛋白的表达水平。3采用流式细胞仪分别检测第3代和第9代培养的毛乳头细胞IGF-1、FGF7蛋白的表达水平,及细胞周期变化和凋亡情况。4 MTT比色分析法检测不同浓度IGF-1(2.5～100ng/ml)对人毛乳头细胞增殖的影响。5 MTT比色分析法检测不同浓度复方甘草酸苷(0.5～100μg/ml)对人毛乳头细胞增殖的影响。6 MTT比色分析法检测不同浓度地塞米松(0.5～100μg/ml)对人毛乳头细胞增殖的影响。7运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计处理,采用t检验、单因素方差分析,以α=0.05为差异显著性标准。结果:1人毛乳头细胞的分离、培养与鉴定1.1人毛乳头细胞的分离、培养经“二步酶消化法”得到的毛乳头,在倒置显微镜下观察呈圆形或椭圆形,第二天即可见贴壁,贴壁1天后可观察到细胞迁出,向四周呈放射状生长。2～3周后细胞大部分生长融合,低倍镜下可见细胞呈漩涡状生长,有多层凝集趋势,细胞呈长梭形。细胞消化传代后第2天可见细胞贴壁展开,随着细胞数目增多,又融合形成多层凝集性生长。细胞传代后增殖速度也加快,尤以3～5代细胞最为显著,且均可见凝集性生长。随毛乳头细胞传代次数增加,凝集性逐渐消失,细胞变为多极、梭形或细长的成纤维细胞样,生长速度变慢,传代周期明显延长。1.2人毛乳头细胞的鉴定人毛乳头细胞α-SMA免疫组化染色呈阳性。2免疫组织化学S-p法分别检测3代、9代细胞IGF-1和FGF7的表达IGF-1与FGF7均表达于细胞胞浆,着色由黄色到褐色不等。3代和9代毛乳头细胞免疫组化染色后IGF-1表达分别为+～++和+;FGF7表达分别为+～++和±～+。3流式细胞仪分别检测3代、9代毛乳头细胞IGF-1、FGF7的表达流式细胞技术检测结果显示,3代、9代毛乳头细胞IGF-1的均道值分别为270.98±26.84、232.14±14.80,前者大于后者,但统计分析表明两者相比无显著性差异(P>0.05)。3代、9代毛乳头细胞FGF7的均道值分别为373.51±24.97、270.91±32.83,前者大于后者,统计学分析表明两者有显著性差异(P<0.05)。4流式细胞仪检测人毛乳头细胞凋亡及细胞周期分布3代和9代毛乳头细胞处于G1期的细胞比率分别为55.53±3.34%、57.53±6.84%;处于S期的细胞比率分别为34.87±3.18%、34.10±6.36%;处于G2期的细胞比率分别为7.82±3.37%、8.40±3.19%。各期细胞两者比较均无明显差异(P>0.05)。两组细胞的凋亡率分别为1.36±0.24%、1.28±0.63%,无统计学差异(P>0.05)。5 IGF-1对人毛乳头细胞增殖的影响处于对数生长期的第4代毛乳头细胞加入不同浓度的重组人IGF-1培养72h后,MTT结果显示与对照组相比,各浓度组均有明显促进毛乳头细胞增殖的作用(P<0.05),其中以2.5ng/ml最为显著,其余各组间无明显差异,浓度再增加,促增殖作用并不增强。6复方甘草酸苷对人毛乳头细胞增殖的影响处于对数生长期的第4代毛乳头细胞加入不同浓度的复方甘草酸苷培养72h后,MTT结果显示在0.5～20μg/ml浓度内,促增殖作用呈剂量依赖性,以20μg/ml组刺激作用最强,有统计学意义(P<0.05),浓度再增加,其促增殖作用反而减弱。7地塞米松对人毛乳头细胞增殖的影响在处于对数生长期的第4代毛乳头细胞中加入不同浓度的地塞米松培养72h后,MTT结果显示在0.5～2.5μg/ml浓度内,促增殖作用呈剂量依赖性,以2.5μg/ml组刺激作用最强,有统计学意义(P<0.05),浓度再增加,其促增殖作用有所减弱。结论:1二步酶消化法可简便、快捷、有效地分离获得毛乳头。体外培养的毛乳头细胞在6代之前呈明显的凝集性生长特性,继续传代该特性逐渐消失。2凝集性与非凝集性生长的毛乳头细胞各细胞周期与凋亡均无明显差异,表明体外培养的毛乳头细胞维持在比较稳定的增殖状态。3 FGF7在凝集性生长的毛乳头细胞中表达明显高于非凝集性生长的毛乳头细胞,推测凝集性生长的毛乳头细胞促进毛母质细胞增殖角化可能与FGF7有关。4 IGF-1可明显刺激毛乳头细胞增殖,同时受毛乳头细胞表面的IGF结合蛋白调节。IGF-1在凝集性生长的毛乳头细胞中表达高于非凝集性生长的毛乳头细胞,但无统计学差异,IGF-1促进毛囊生长的机制有待进一步探讨。5复方甘草酸苷和地塞米松在抗炎、免疫调节及抑制的同时还可能通过调节毛乳头细胞的活性,诱导毛发生长。
