一、目的和意义子宫内膜癌作为女性生殖道最常见三大恶性肿瘤之一,约占女性生殖道癌瘤的20%—30%,而且近年来其发病率有上升趋势。子宫内膜样腺癌占子宫内膜癌的3／4,其发病原因一直是人们研究的热点,现在认为其主要原因为持续、长期、异常的雌激素的刺激,和／或缺乏孕激素的拮抗。人体内的雌激素来源广泛,主要来源于卵巢、胎盘,绝经后妇女主要来源于肾上腺。雌激素在子宫内膜样腺癌的发生发展过程中起了重要的作用。因此,研究雌激素的作用机制对明确子宫内膜样腺癌发病机制有着重要的意义。经典的雌激素信号传导由雌激素受体(estrogen receptor, ER)与配体结合并诱导ER的构象改变开始,ER解离热休克蛋白(heat shock protein, HSP)形成E-ER复合物,可以直接与雌激素反应单元序列(estrogen relative element, ERE)结合,也可间接地通过蛋白质间相互作用与在启动子结合,从而增高或降低mRNA的水平和相关蛋白的产生,进而引起各自相应的生理反应。核受体超家族(nuclear receptor superfamily, NRs)是一类成员众多的超家族转录因子,其中包括经典的配体依赖性受体和数目众多的孤核受体。雌激素受体相关受体(estrogen receptor-related receptor, ERR)和ERs同属于第3型核受体家族。目前,已发现ER有两种亚型,即ERα和ERβ、ERRs有三种亚型,即ERRα、ERRβ和ERRγ。ERα早在上世纪八十年代即被发现,并被认为是唯一的ER,直至十年后ERβ才被发现。ERRα、ERRβ最初是利用ERα受体的DBD区作为探针采用低严谨杂交技术从肾cDNA文库中筛选出来,而ERRγ则于1999年利用GRIP1蛋白为诱饵通过酵母菌双杂交技术筛选得到。ERRs和ERs分享了NRs家族的结构特征,并且二者氨基酸序列和基因序列具有很高的同源性。其基因结构主要为含有5个功能区的结构域,其中研究比较多的是A/B、C、E区：A/B区含有配体结合区1 (ligand-dependent activation function 1, AF-1),其特异性较低,可以结合不同的因子以激活靶基因；C区被称为DNA结合区(DNA-binding domain, DBD), ERα和ERβ在此区的同源性高达95%,ERRα与ERα此区同源性为66%, ERRγ的DBD与ERRα相比有93%一致；E区含有一个被称为激素结合区(ligand-binding domain, LBD)的结构域和一个配体结合区2(ligand-dependent activation function 2, AF-2), ERα和ERβ在LBD的同源性达55%, ERRα与ERα此区同源性为33%。雌激素信号传导中,ERs反应元件ERE和ERRs的反应元件(ERR responsive element, ERRE)也具有较高的同源性。ERE是5’-TGACCTnnnAGGTCA-3’反向回文序列(n为任一核苷酸),其核心为5’-AGGTCA-3’序列。ERR单体识别的是则ERRE,该元件是具有相同核心并向5’端延伸3个核苷酸的序列,即5’-TnA-AGGTCA-3’。因此,ERs和ERRs均可识别以5’-AGGTCA-3’序列为核心的激素反应元件,且ERRs在体内未发现相应的天然配体,因此ERRs和ERs对ERE的转录活性具有相似性、竞争性。含有此核心序列的HRE结构变异体在人体内广泛存在,比如：完整或不完整的ERE元件、ERRE元件、回文性的甲状腺素反应元件(thyroid response element,TRE)以及甾体生成因子-1(SF-1因子)的反应元件(steroid factor-1 responsive element,SFRE)。这些都成为ERRs和ERs广泛参与代谢并产生交互作用的基础。因而两个家族可能在子宫内膜样腺癌的发生、发展方面也发挥了重要作用。有研究表明ERα和ERβ可以形成ERα同源二聚体、ERβ同源二聚体或ERα/ERβ异源二聚体与ERE结合,以不同的活性参与调控不同配体的生物学效应。ERRα也可以形成单体、同源二聚体识别ERRE产生雌激素效应或与ERα形成异源性二聚体干扰ER的基因调控。而ERRα的作用及活性在某种程度上又取决于ERα对ERE的结合程度。ERRγ也是ERRα在表达过程中密切联系的家族成员,有研究表明ERRγ有调节ERRα表达水平的作用。而小鼠实验表明ERRα减少会引起ERRγ上调。因此,研究ERRα、ERRγ、ERα和ERβ在子宫内膜组织表达对明确子宫内膜样腺癌的发生发展有着重要的意义。Ariazi等用real-time PCR的方法测量了ERRs和ERs在乳腺癌组织中的mRNA的表达,并评价了ERRα、ERRγ作为乳腺癌肿瘤标记物的作用和及其在癌症患者预后评估中的作用。Kraus等曾对ERα(+)的乳腺癌细胞和ERα(-)的宫颈癌细胞中的ERRα进行分析,他发现ERRα与ERα的表达关系密切。孙蓬明等用实时荧光定量PCR方法测量了ERRs和ERs在卵巢癌组织中的mRNA的阳性表达率,也认为ERRs与ERs在卵巢组织中的相互作用可能是卵巢癌复杂的肿瘤内分泌生物学行为的分子基础。鉴于既往研究的结果,我们认为作为雌激素依赖性肿瘤的子宫内膜样腺癌,其发生发展的过程有可能与两个家族相互作用的分子机制有关。目前,国内外的对ERR的研究主要停留在乳腺癌、卵巢癌上,对子宫内膜癌的研究也主要停留在细胞学上,采用的方法也多是采用普通PCR或免疫组化所做的定性研究。而对属于雌激素依赖性子宫内膜癌的子宫内膜样腺癌的报道也颇为罕见。因此,本研究拟对ERs和ERRs两个核受体家族在子宫内膜样腺癌发病过程中的量的变化及相关关系进行探讨。本研究采集子宫内膜组织标本进行检测,并纳入癌旁组织与癌组织、正常组织比较。结合考虑肿瘤的生物学行为,及癌旁组织的病理类型,我们用癌旁组织评价正常内膜发展到癌之间的癌前病变。采用Taqman荧光定量PCR的方法检测ERRα、ERRγ、ERα和ERβ在子宫内膜的癌变过程中mRNA的表达量的变化,并结合子宫内膜样腺癌患者的临床病理资料进行综合分析,探讨ERRs和ERs在子宫内膜的癌变过程中表达的相关性及其临床意义,以期为揭示子宫内膜样腺癌的发生机制提供新的思路与靶点。二、方法与内容1.研究对象本研究共收集44例子宫内膜样腺癌组织、30例正常组织及30例癌旁组织,所有标本均经病理切片HE染色明确诊断后纳入,手术病理分期按2000年国际妇产科联盟(FIGO)的标准进行分期,所有患者术前均未接受放、化疗及激素治疗。2.研究方法采用TRIzol一步法提取所有组织总RNA,检测所有组织总RNA的质量和完整性,再将总RNA逆转录转成cDNA,采用荧光实时定量PCR的Taqmari探针法测量所有组织标本中ERα、ERβ、ERRα及ERRγmRNA的表达水平,用标准曲线的相对定量法计算目标基因表达量。3.统计学方法采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。ERα、ERβ、ERRα、ERRγmRNA表达水平差异及ERα/ERβ、ERα/ERRα、ERRα/ERRγ比值的变化三组比较采用非参数法Kruskal-Wallis H检验,进一步做两两比较采用Nemenyi法。采用Spearman等级相关分析癌组织中ERα、ERβ、ERRα、ERRγ四项指标与分期、分级的关系。P<0.05为有统计学意义。三、结果1.选择2008年1月1日～2009年9月30日在南京军区总医院妇科住院治疗并且病理诊断为子宫内膜样腺癌的患者44例,年龄33～79岁,平均年龄54.05±9.25岁；其中手术病理分期：Ⅰ期25例,Ⅱ期13例,Ⅲ期6例,Ⅳ期0例；病理分级：G17例,G224例,G313例；绝经后24例,绝经前20例。同时选取远离癌灶的内膜组织作为癌旁组,共30例。选取因非子宫内膜疾病行子宫全切术且病理证实为正常组织的子宫内膜组织30例作为正常对照,年龄35-77岁,平均年龄52.37±10.23岁；绝经后16例,绝经前14例。各组间年龄及绝经情况比较均无统计学意义(P>0.10),具有可比性。2.所有组织总RNA的质量和完整性良好,标准曲线表明实验扩增效率高,所得数据可信度高。3.各组ERα、ERβ、ERRα、ERRγmRNA表达水平：ERα、ERRγ在三种组织中的表达趋势为癌旁组织最高,癌组织最低；ERβ、ERRα在三组中的表达趋势为癌旁组织最高,正常组织最低。四项指标三组间比较均有统计学差异(四项P值均<0.001)。进一步两两比较,ERα、ERβ、ERRα三种基因的癌旁组织均明显高于其它两组,差异均有统计学意义(P<0.05),但只有ERα的正常组织与癌组织间比较有统计学意义(P<0.05)。ERRγ的表达只有癌组织和癌旁组织间有显著性差异(P<0.005)。4.各组ERα/ERβ、ERα/ERRα、ERRα/ERRγ比值的变化：ERα/ERRα和ERα/ERβ比值的表达趋势为正常组织>癌旁组织>癌组织；ERRα/ERRγ比值的表达趋势为癌组织>癌旁组织>正常组织。进一步两两比较,三项比值的正常组织与其它两组比较差异均有统计学意义(P<0.005),但癌旁组织与癌组织间比较无统计学意义(P>0.50)。5.ERα、ERβ、ERRα、ERRγmRNA及比值ERα/ERβ、ERα/ERRα、ERRα/ERRγ在癌组织中不同分期中的表达：癌组织中只有ERRα与分期呈中度正相关,相关关系有统计学意义(P=0.004),即癌组织中ERRα含量越高,分期也越晚；比值中只有ERα/ERRα与分期呈轻度负相关,相关关系有统计学意义(P=0.019),即癌组织中ERα/ERRα比值越高,分期也越早。其余指标与分期的相关关系均无统计学意义(P>0.50)。6. ERα、ERβ、ERRα、ERRγmRNA及比值ERα/ERβ、ERα/ERRα、ERRα/ERRγ在癌组织中不同分级中的表达：癌组织中ERα、ERβ与分级呈中度正相关,ERRα与分级呈轻度正相关,相关关系均有统计学意义(P<0.01),即癌组织中ERα、ERβ和ERRα含量越高,分级也越高,分化程度越低,反之亦然；ERRγ与分级的相关关系无统计学意义(P>0.10)。癌组织中三项比值与分级的相关关系均无统计学意义(P>0.50)。四、结论1.ERα、ERβ、ERRα及ERRγ四项指标在癌旁组织中的表达均明显高于正常组织和癌组织,即癌前组织中ERs和ERRs的异常活跃可能是子宫内膜细胞癌变的原因之一。但癌组织与正常组织只有ERα有显著的差异,其余受体无差异。2. ERα、ERRγ相对低表达,ERβ、ERRα相对高表达在内膜细胞向癌细胞进展过程中起着非常重要的作用。尤其是三项比值指标ERα/ERβ、ERα/ERRα、ERRα、/ERRγ的变化可能有利于监测子宫内膜的早期癌变。
