广西沼泽型水牛细胞因子基因的克隆与序列分析--IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12（p35、p40）、IL-18和TNF-α

本实验将本地沼泽型成年水牛外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMO)在刀豆素A(Concanavalin A，ConA)的刺激下体外培养，提取培养的单核细胞总RNA，应用逆转录聚合酶链式反应(RT-POR)技术扩增水牛白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、白细胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)、白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)，并克隆到pMD18-T载体上，然后进行测序。序列分析显示，克隆的IL-2 cDNA长724bp，包括一个全长为468bp的完整编码区(ORF)，共编码155个氨基酸，分子量为17.5KDa。在核苷酸水平上与印度水牛、牛、绵羊、山羊、猪、狗、人和鼠的IL-2基因同源性为99.6％、98.5％、98.3％、97.4％、85.6％、78.4％、80.3％、65.2％；推导的氨基酸序列同源性为98.7％、96.8％、96.2％、94.2％、72.9％、61.5％、64.9％、48.7％。克隆的IL-4 cDNA长469bp，包括一个全长为408bp的完整编码区(ORF)，共编码135个氨基酸，分子量为15.0KDa。在核苷酸水平上与印度河流型水牛、牛、绵羊、猪、马、鼠和人的IL-4 cDNA同源性分别为98.8％、99.3％、94.1％、84.8％、80.6％、62.7％和75.2％；推导的氨基酸的同源性分别为96.3％、98.5％、90.4％、78.4％59.6％、39.0％和64.7％。克隆的IL-5 cDNA序列，长430bp，ORF为405bp，共编码134个氨基酸，分子量为15.3KDa。经与GenBank中牛、绵羊、猪和马的IL-5 cDNA序列比较可知，所克隆的基因与它们的同源性分别为99.0％、96.5％、89.6％和89.1％。氨基酸的同源性分别为97.8％、96.2％、85.9％和86.7％。克隆的水牛IL-10的完整编码区cDNA序列，经分析其开放阅读框架(ORF)长为536bp，编码178个氨基酸，分子量为22.4KDa。与GenBank中印度河流型水牛、牛、羊、猪、马、人和鼠的IL-10 cDNA序列比较可知，所克隆的IL-10基因与它们的同源性为99.6％、97.2％、93.6％、83.9％、89.0％、85.1％和75.8％。氨基酸的同源性为100％、93.3％、89.3％、79.5％、88.2％、80.9％和74.2％。克隆的水牛IL-12 p35基因序列全长694bp，含一个全长为666bp的完整开放阅读框(ORF)，编码222个氨基酸，推测其分子质量为24.86kDa。与GenBank登录的印度河流型水牛p35的核苷酸同源性为99.7％，氨基酸同源性为98.6％，与牛、羊、猪、马、人和鼠的核苷酸同源性为98.5％、97.7％、77.6％、85.3％、85.3％和70.0％，氨基酸同源性为97.3％、95.5％、68.5％、79.7％、81.1％和55.9％。克隆的水牛IL-12 p40基因序列全长1013bp，含一个全长为984bp的完整开放阅读框(ORF)，编码328个氨基酸，推测其分子质量为37.03 kDa。与GenBank登录的印度河流型水牛p40的核苷酸同源性为99.5％，氨基酸同源性为98.8％，与牛、羊、猪、人和鼠的核苷酸同源性为98.6％、97.4％、81.1％、87.7％和74.9％，氨基酸同源性为97.6％、96.0％、75.6％、83.8％和67.7％。克隆的水牛IL-18基因序列全长602bp，含一个全长为582bp的完整开放阅读框(ORF)，编码193个氨基酸，推测其分子质量为22.18kDa。与GenBank登录的印度河流型水牛IL-18的核苷酸同源性为99.1％，氨基酸同源性为99.0％，与牛、绵羊、山羊、猪、马、人和鼠的核苷酸同源性为99.3％、97.8％、97.1％、91.5％、91.6％、85.6％和67.7％，氨基酸同源性为98.5％、94.8％、94.3％、89.1％、、87.1％、77.8％和60.6％。克隆的水牛TNF-α基因序列全长715bp，含一个全长为705bp的完整开放阅读框(ORF)，编码234个氨基酸，推测其分子质量为25.56kDa。与GenBank登录的印度河流型水牛TNF-α的核苷酸同源性为99.7％，氨基酸同源性为98.7％，与牛、绵羊、山羊、猪、人的核苷酸同源性为98.6％、95.6％、96.2％、84.0％和73.0％，氨基酸同源性为97.9％、91.5％、91.9％、80.7％和70.6％。这些结果表明本实验成功克隆出水牛的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12(p35、p40)、IL-18和TNF-α基因，为今后研究和利用水牛细胞因子，更全面、更深入地研究水牛免疫系统和有效的防制水牛疾病打下基础。