研究背景:关节损伤后的治疗非常困难,是骨科临床面临的难题,关节损伤后难以修复及功能恢复的关键原因是:关节软骨不能很好的修复,在损伤关节软骨表面尚无有效方法再生透明软骨层。文献报道,幼年新西兰白兔关节软骨损伤后能够接近完全再生,修复组织中透明软骨超过80%,修复组织的机械性能和耐久度接近正常的关节软骨,而成年新西兰白兔在关节软骨损伤部位只能形成纤维瘢痕修复,修复组织透明软骨含量低。这种修复的差异,推测是因为在损伤部位存在着与修复相关的基因表达差异。以具有软骨再生能力的动物为模型,寻找并研究损伤部位局部早期的基因表达,有可能发现关节损伤后再生修复的重要基因,进一步研究目标基因的功能,具有重要意义和价值。目的:利用抑制性消减杂交技术构建幼年新西兰白兔膝关节损伤后修复组织差异表达基因文库,并通过测序、生物信息学检索筛选膝关节损伤后修复相关基因,并进一步通过RACE技术克隆未报到基因全长基因序列,进行蛋白表达、纯化并初步研究其对间充质干细胞增值及形态学的影响。方法:采用一步法和植物RNA提取方法相结合,提取关节损伤修复组织总RNA,应用抑制性消减杂交(SSH)技术,筛选幼年新西兰白兔损伤膝关节修复组织差异表达基因。选择具有亲子关系的50周龄成年新西兰雌性白兔及其子代8周龄幼年新西兰白兔(雌雄不限)共3对。在膝关节股骨关节面背侧用钻头制造直径3mm深3mm的关节软骨及软骨下骨组织的缺损,取伤后4周损伤部位修复组织作为实验标本。幼年新西兰白兔的修复组织为检测组(Tester);成年亲代雌性新西兰白兔的修复组织为驱动组(Driver)。酶切双链cDNA成具有平头末端的小片段,将Tester组平头末端连接接头Adaptor1或Adaptor 2R,与酶切后的Driver组进行两次消减杂交和两轮抑制性扩增,产物连接pMD19-T载体,转化DH5α感受态大肠杆菌,蓝白斑筛选阳性克隆,建立消减cDNA文库。PCR检验阳性插入片断,每个阳性克隆摇菌扩增后送上海生物工程公司测序。应用Chromas软件去除测序结果中载体序列及插入片断两端的接头序列得到抑制性消减EST片断,应用DNAStar 5.01对片断进行重叠群合并及电子拼接,得到差显基因片断的序列信息,在GeneBank数据库中进行同源性检索,反向Northern斑点杂交验证差显基因片段,选择有意义的已知基因及未报到基因片段进行后续功能研究。应用RACE技术克隆未报到的10号和12号差异表达基因片段的全长基因序列,通过电子拼接获得电子全长,并通过高保真酶扩增出物理全长,以pQE30为载体,构建原核表达载体,进行蛋白表达、纯化,获得目标基因的蛋白表达产物。抽取成年新西兰白兔骨髓组织,通过全骨髓培养法进行骨髓间充质干细胞的分离和纯化,应用MTT技术检测不同浓度梯度的目标蛋白对间充质干细胞增值的影响,选择促进增值作用最强的蛋白浓度进行间充质干细胞的培养,通过免疫荧光技术,对间充质干细胞的细胞骨架进行染色,观察目标蛋白对间充质干细胞形态学的影响。研究已知基因VEGF在关节损伤修复过程中的作用。成年新西兰白兔60只,随机分成基因转染组、空白对照组和空载体对照组。构建AdhVEGF121腺病毒表达载体,通过无水酒精注射造成股骨头坏死模型,进行目的基因转导,于损伤后不同时相点处死动物,取坏死区关节软骨及软骨下骨组织,通过RT-PCR检测VEGF在修复组织中的表达,通过HE染色进行病理学观察,并对修复组织的软骨下骨进行骨密度测量及骨小梁形态学测量,利用SPSS 13.0进行统计学分析,比较各组的修复差异。结果:一步法结合植物RNA提取法提取的总RNA简单快速、纯度高、完整性和稳定性好,成功逆转录合成双链cDNA。应用SMART与SSH相结合的技术构建了幼年新西兰白兔关节损伤修复组织差异表达cDNA文库。蓝白斑筛选获得223个阳性菌落,随机选择64个阳性克隆进行PCR验证,真阳性率超过90%。送217个测序,成功测序199个。通过软件拼接得到13个差异表达基因序列信息,反向Northern杂交证实13个差显基因有12个均在幼年新西兰白兔修复组织中高表达,包括6条线粒体基因、核糖体基因和管家基因。有一条基因表达无明显差异。其余6个基因片断,有4条是已知基因片段,分别是A6:XI型胶原α1链,A37:兔皮质稳定素4,A45:人类PRO1073,A79:血管内皮细胞生长因子。另外2条基因,克隆编号:A78、A80,经过检索未见全长基因报到,只有部分序列(CDS)报道,且在幼年新西兰白兔损伤关节修复组织中高表达。差显基因片断均在GeneBank登录并获得注册。应用RACE技术成功克隆了未报到的10号和12号差异表达基因片段的全长基因序列,通过电子拼接获得乐全长序列信息,在GenBank中获得注册,注册号为FJ571518何FJ571519。.根据电子全长设计基因特异性引物,通过高保真酶扩增出物理全长,经过对全长基因序列的同源性检索,10号序列与Ⅰ型胶原前α2链有较高的相似性,相似度为99%,Ⅰ型胶原被称为骨胶原,国内外有大量研究报道。因此放弃对其进行后续研究。12号基因与人S100A9有较高相似度,相似率为90%。查阅文献未见S100A9在关节损伤中的报道。因此对此基因继续后续研究。利用pQE30载体成功构建目的基因原核表达载体pQE30-12-IGI,通过蛋白表达、纯化,获得了目标基因的蛋白表达产物100微克左右,蛋白为可溶性蛋白。通过全骨髓培养法成功分离纯化出骨髓间充质干细胞进行了传代培养,对传代细胞, MTT检测发现12号蛋白能够明显促进充质干细胞增值,免疫荧光染色发现12号蛋白引起间充质干细胞细胞骨架增生,细胞发生肥大性反应。通过RT-PCR检测发现在目的基因转染组坏死股骨头关节软骨及软骨下骨的修复组织中VEGF表达明显高于对照组,转染VEGF后,HE染色提示软骨下坏死区新生的骨小梁明显优于对照组,而在两个对照组,均有不同程度的骨吸收及空隙形成。目的基因转染组的骨密度明显高于2个对照组,骨小梁平均宽度大于对照组,骨小梁平均间隙小于对照组,结果具有统计学意义。结论:1、植物总RNA提取方法与一步法结合,简便、快速、经济,适合提取关节软骨组织小量总RNA。2、幼年新西兰白兔关节损伤4周后,基因表达明显活跃,反向Northen斑点杂交提示有12个基因表达明显上调,其中包括与软骨细胞及骨细胞的细胞外基质的合成及新陈代谢密切相关的已知差异表达基因:血管内皮细胞生长因子、皮质稳定素4、XI型胶原α1链,以及2个未见全长基因报道的基因片断。进一步研究这些差异表达基因具有重要意义。3、应用RACE技术成功克隆出A78号、A80号基因的全长序列信息,同源性检索鉴定10号基因与人类Ⅰ型胶原前α2链有高度的同源性,12号基因与人类S100A9基因具有较高同源性,在GenBank中均获得注册。通过对目标基因12号基因的蛋白表达和纯化,获得了有活性的蛋白表达产物。12号蛋白能够明显促进骨髓间充质干细胞增值,并能够引起骨髓间充质干细胞细胞骨架增生,细胞发生肥大性反应。4、差异表达基因VEGF可能通过促进股骨头坏死区血运重建及骨的形成,间接保护坏死区骨小梁不被吸收及坏死区关节软骨的正常形态,避免损伤关节软骨及软骨下骨机械性能的降低,防止关节退变。
