HSV-1碱性核酸酶AN在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定

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碱性脱氧核糖核酸酶(alkaline deoxyribonuclease,AN)由HSV-1的ul12基因编码,在碱性条件下同时拥有核酸外切酶活性和核酸内切酶活性,理论分子量为68.3kD,AN是HSV-1的复制关键酶。对细胞感染UL12无效突变体的子代病毒产量的分析表明了UL12在衣壳化之前参与识别HSV-1复制中间体分支结构,这些发现表明AN能成为抗疱疹病毒的一种新靶点。前期我们克隆了HSV-1 SM44株(来自中国生物制品检验所)的ul12基因,构建了原核重组表达质粒pET32a-UL12,表达产物AN在大肠杆菌BL21中以包涵体形式存在,对其进行溶解、复性和活性检测,虽然得到有核酸酶活性的蛋白,但复性困难和蛋白收率降低,不利于AN的大规模制备,使AN的进一步应用受到了限制。目的用毕赤酵母系统表达AN,以便得到足量、可溶的活性蛋白AN。方法1.目的基因ul12-2的合成:NCBI上查阅目的基因ul12-2 HSV-1国际标准株17株的序列,在不改变其氨基酸序列的前提下,利用软件对密码子进行优化,选择毕赤酵母表达偏好的密码子,设计一条新的基因序列ul12-2,在基因两端分别引入酶切位点EcoR I和Not I,同时加入含6个组氨酸的His-tag,基因全长1913bp,由上海瑞楚生物科技有限公司合成。2.真核表达载体pPIC9K-UL12-2的构建:将ul12-2基因序列经EcoR I和Not I双酶切后,与同样经过EcoR I和Not I双酶切的酵母表达载体pPIC9K进行连接,转化DH5α,提取质粒pPIC9K-UL12-2。3.筛选毕赤酵母pPIC9K-UL12-2重组子:参照文献[1]利用Sal I酶对重组质粒pPIC9K-UL12-2进行线性化,然后电转化整合入毕赤酵母菌GS115,在组氨酸缺陷平板上筛选转化子。通过G418抗性筛选及分析表型得到最利于外源基因表达的重组子。4.在摇瓶上诱导表达an:对筛选出的重组子分别在锥形瓶里诱导表达。诱导方法参照文献[2]做了改进,挑取单菌落接种至10mlbmgy培养基中,于28℃,250-300r/min振荡培养过夜至od600为6左右;室温1500g/min离心收集菌体,用bmmy培养基重悬菌体,使od600在15-60之间,将菌液移入新的摇瓶继续振荡培养;每12h向培养基中补充一次甲醇至终浓度为0.5%,间隔24h取样一次,离心收集上清液,表达产物采用sds-page进行检测。5.an的纯化:依据前期sds-page电泳检测的结果,考虑将诱导上清进行阳离子交换层析和阴离子交换层析两步纯化后再行分析。6.纯化后an的活性检测:按本课题组前期的an活性检测方法[3],参考joelc.bronstein等[4]的酶活性检测方案加以改进,通过an对线性化puc19的降解程度来检测an的核酸外切酶活性。结果1.对合成的ul12序列做核苷酸测序检测。结果显示合成的序列中含hsv-117株的ul12基因,与我们设计的一致。2.构建了真核表达载体ppic9k-ul12-2,对其进行双酶切后发现经ecori/noti双酶切可分别得到约1.9kb和9.3kb的片段,其中1.9kb片段为我们的目的片断ul12-2,同时对重组载体进行了测序鉴定,证明构建成功。3.重组载体ppic9k-ul12-2转化毕赤酵母,得到了40个转化子,所有转化子经pcr鉴定,筛选出8个阳性重组子。对这8个菌株在mm和md培养基上鉴定其表型,结果均为his+/mut+。4.对不同时间段的诱导上清液分别进行sds-page检测,结果表明在约68.3kd处有目的条带显示,但同时有多条杂带存在。5.采用强阳离子交换层析(sp柱)和强阴离子交换层析(q柱)对诱导上清液an进行分离纯化。经sds-page检测经过这二次离子交换层析纯化后的an基本能看见单一条带。6.在采用经过二次离子交换层析纯化的an与线形化的puc19做酶切反应时,线性片段被完全水解,这说明an具有核酸外切酶活性。结论构建了重组质粒pPIC9K-UL12-2,筛选到能表达目的蛋白的高抗性阳性重组子,说明毕赤酵母成功表达了具有核酸外切酶活性的碱性核酸酶AN,这为AN的大量制备与抗HSV-1新药的研发奠定了基础。
摘要第7-10页
Abstract第10-12页
前言第13-15页
第一部分 碱性核酸酶AN毕赤酵母表达载体的构建第15-30页
    1 实验材料第15-17页
        1.1 菌株和质粒第15页
        1.2 主要试剂第15页
        1.3 主要仪器设备第15-16页
        1.4 主要试剂、溶液配制第16-17页
    2 实验方法第17-23页
        2.1 DH5α 感受态细胞的制备[16]第18页
        2.2 新设计合成的ul12-2 序列的获得第18-19页
            2.2.1 引物设计及测序比对第18-19页
            2.2.2 目的基因ul12-2 的设计与合成第19页
        2.3 重组质粒pPIC9K- UL12-2 的构建第19-23页
            2.3.1 目的序列ul12-2 的PCR产物双酶切第19-20页
            2.3.2 pPIC9K质粒的双酶切反应第20页
            2.3.3 酶切产物的连接反应第20-21页
            2.3.4 将连接产物pPIC9K -UL12-2 转化DH5α[16]第21页
            2.3.5 阳性重组子的筛选鉴定第21-23页
    3 实验结果第23-27页
        3.1 含 6×His标签ul12-2 的获得第23-26页
        3.2 含 6×His标签重组质粒的构建及鉴定第26-27页
    4 讨论第27-30页
第二部分 AN的毕赤酵母重组子的筛选及表达第30-45页
    1 实验材料第30-34页
        1.1 菌株和质粒第30页
        1.2 主要试剂第30-31页
        1.3 主要仪器设备第31页
        1.4 主要溶液及试剂配制第31-34页
    2 实验流程第34-38页
        2.1 制备转化酵母菌GS115的线性质粒pPIC9K-UL12-2第35-36页
        2.2 制备GS115感受态细胞[1]第36-37页
        2.3 线性化质粒电转化GS115[1]第37页
        2.4 His~+转化子的筛选第37页
        2.5 阳性转化子pPIC9K-UL12-2/GS115在摇瓶诱导表达第37-38页
        2.6 目的基因ul12-2 表达蛋白AN的检测第38页
    3 结果第38-41页
        3.1 制备转化酵母菌GS115的线性质粒pPIC9K-UL12-2第38-39页
        3.2 酵母转化菌GS115的PCR鉴定以及表型鉴定第39页
        3.3 蛋白水平的检测第39-40页
        3.4 碱性核酸酶AN的时间诱导表达分析第40-41页
    4 讨论第41-45页
第三部分 AN的纯化与活性鉴定第45-59页
    1 实验材料第45-48页
        1.1 菌株第45页
        1.2 主要试剂第45-46页
        1.3 主要仪器设备第46页
        1.4 主要溶液及试剂配制第46-48页
    2 实验方法第48-52页
        2.1 目的蛋白AN在毕赤酵母中的诱导表达第48页
        2.2 质粒pUC19的提取第48-49页
        2.3 酶切质粒pUC19第49-51页
        2.5 AN的亲和层析纯化第51-52页
        2.6 AN的离子交换层析纯化第52页
    3 结果第52-57页
        3.1 重组AN对线性片段的酶切反应第52-53页
        3.2 重组目的蛋白AN的亲和层析纯化第53-54页
        3.3 强阳离子交换层析(SP柱)第54-56页
        3.4 强阴离子交换层析纯化(Q柱)第56-57页
    4 讨论第57-59页
全文总结第59-60页
参考文献第60-63页
文献综述 植物药物治疗单纯疱疹病毒的研究进展第63-72页
    参考文献第69-72页
附录第72-74页
攻读硕士学位期间研究成果第74-75页
致谢第75页
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