基于纳米量子点标记肿瘤标志物检测系统研究

量子点荧光标记技术发展日新月异，已成为一种新型荧光标记物。因其独特的荧光光学特性，量子点成为标记肿瘤标志物的理想荧光探针。肿瘤标志物也叫做肿瘤标记物，是肿瘤细胞在癌变过程中癌基因表达生成的抗原和其它生物活性物质。由于肿瘤标志物具有特异性高、检测方便及出现的时间早等优点，已被广泛应用于临床。肿瘤标志物的检测与其诊断方法相结合能大大提高肿瘤早期诊断率。量子点标记肿瘤标志物检测技术和传统的肿瘤标志物检测手段不同，主要是利用肿瘤标志物和偶联量子点的特异性抗体发生免疫夹心反应，检测反应物免疫量子点的荧光产率即可表征肿瘤标志物的含量。本课题为了研究量子点标记肿瘤标志物检测技术，研制了两台基于量子点免疫层析试纸条的检测分析仪器和一套基于量子点编码微球的液相芯片实验平台。同时，应用这两套系统对肿瘤标志物进行了实验室检测和临床试验。文章对肿瘤标志物检测方法进行对比，结果表明，基于量子免疫层析试纸条法价格低廉、检测快捷、操作简便、重复性和特异性强，灵敏度高，适合我国广大中小医院对肿瘤标志物的检测和筛查。本文的创新性工作如下：1、克服流式细胞仪、Luminex等设备对荧光编码微球检测时无法检测荧光光谱完整信息的局限性，构建了以光纤光谱仪解码器件的液相芯片检测系统，实现了编码微球的海量解码和高通量检测。本系统以CCD实时图像对编码微球实时定位和冗错，以光纤光谱仪对量子点编码微球的编码荧光光谱进行实时检测解码，以光子计数器实时检测免疫量子点的目标荧光对肿瘤标志物浓度进行计算。研究了该系统测定AFP的方法，通过标定患者血清中AFP浓度和目标荧光强度的工作曲线，对血清中AFP进行工作曲线法检测，检出限达到1ng/mL。2、本文应用小波变换对重叠峰展开技术，对两种相邻波长量子点的编码荧光进行解码识别。实现量子点荧光海量编码，量子点的荧光发射峰必定出现重叠，造成量子点编码识别的困难。经过小波变换处理后，峰位置保持不变，能够提取编码荧光光谱的特征值。通过小波变换，重叠荧光光谱被展开，能够识别出两种量子点的荧光编码，提高了识别的分辨率。通过提高对相邻光谱的编码的识别，量子点编码的颜色必将增加，从而显著丰富编码的信息量，为实现肿瘤标志物的高通量检测奠定基础。3、研制了两台量子点免疫层析试纸条检测分析仪，实现了肿瘤标志物的快速、简洁、灵敏和准确检测。应用量子点免疫层析试纸条检测分析仪对试纸条的反应时间和加样剂量进行了研究，确定最佳静置反应时间为10min，最佳加样量为50uL。实验研究结果表明，仪器的检出限为1ng/mL，同一试纸条检测重复性误差小于1%。研究了仪器检测血清中肿瘤标志物AFP浓度的方法，标定了AFP工作曲线法及运用该曲线检测血清中的AFP浓度；同时，仪器运用标准加入法快速检测AFP浓度，误差小于5%。本仪器在医院做了千例检测患者血清中AFP临床试验，并与ECLIA法相对照。结果表明，本仪器的检测结果与ECLIA相比，准确性和灵敏度相一致，能够满足临床上对肿瘤标志物的检测要求。4、对量子点免疫层析试纸条高通量检测做了初步研究，提出了运用颜色编码免疫量子点制作颜色编码多通道试纸条，在检测线的荧光光谱中剔除非特异性吸附免疫量子点荧光的理论和算法，剔除非特异性吸附影响因素，使高通量检测的精度得到保障。